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海带EST-SSR标记开发及TPS基因的克隆和比较遗传学研究

作　者: 王国良
导　师: 刘涛；翁曼丽
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 海带 EST-SSR 海藻糖合成酶(TPS)基因基因克隆比较遗传学
分类号: S968.421
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

海带是重要大型经济海藻,也是我国人工栽培历史最长和产量最高的海藻,我国海带养殖面积、养殖产量均居世界首位。海带广泛应用于食品保健、海洋药物、化工原料、农业肥料等方面,具有较高的经济价值,是我国海水养殖的支柱产业之一。另外海带生物量巨大,是近海潮下带的重要初级生产力之一,对调节优化养殖环境具有重要的生态作用,其综合利用和可持续发展越来越受重视。海带生活史中典型的异型世代交替现象以及孤雌生殖和无配生殖现象,也使之成为藻类学和遗传学研究的良好模式生物。自海带引入我国后,经过几十年的发展,其遗传育种、育苗及栽培技术取得了很多进展。与海带栽培技术研究相比,目前有关海带遗传多样性分析、经济性状遗传等应用基础研究还相对落后。由于海带中多糖和酚类物质含量较高、染色体数目众多且基因组较大,海带的分子遗传学、基因研究及分子标记工作进展较为缓慢。目前,已公布的可直接应用于遗传性状研究的分子标记数量有限。在开发利用海带资源的过程中,种质问题也是是困扰其生产的一个重大问题,本研究利用海带EST数据,进行EST-SSR筛选、引物设计和验证应用,进行种质遗传多样性分析。从4099条海带属EST中(其中971条来自我们构建的两个cDNA文库,3128条从NCBI网站下载)筛选微卫星位点,设计合成63对引物,优化反应体系后,应用于12个海带属材料分析,最终开发出23对EST-SSR引物,用这23对EST-SSR引物对12个海带属材料进行了遗传多样性分析,并能较好的将不同来源的样品区分开来。这23对EST-SSR引物具有很好的实用性,可以用于海带的分子生物学研究,特别是功能基因的研究。海藻糖是一种广泛存在于自然界中的非还原性双糖,研究表明它能提高植物抵抗温度、pH等变化的能力,是一种前景广阔的食品药品稳定剂、添加剂和植物抗逆保护剂。分离有关海藻糖合成酶的基因,应用生物工程的手段引入植物,可以提高植物抗干旱、抗盐碱的能力。本研究用同源克隆的方法,通过优化PCR反应体系,从海带、裙带菜、亨氏马尾藻等海藻中克隆了海藻糖合成酶基因TPS,其保守域长度为2727bp,并用生物信息学方法对已得到的海藻TPS基因的cDNA序列进行了比较研究,发现它们之间的同源性都高于94.4%,海带的TPS蛋白与其它各种海藻TPS蛋白的氨基酸序列同源性则都高于96.6%。将这些海藻TPS基因的DNA序列与已报道的其它几种生物(大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、水稻)的TPS基因的序列(EcOtsAB, ScTPS2、AtTPS5、OsTPS)进行了比对,发现十种海藻TPS基因的序列是相对保守的,这说明他们的功能应该是相似的；其它几种生物的TPS基因中,与海藻同源性最高的是水稻和拟南芥的TPS基因,它们之间的同源性达到40%以上,同源性次之的是酵母的TPS基因,它们之间的同源性只有27%左右；最低的是与大肠杆菌之间的同源性,它们的同源性仅仅只有20%左右。这与它们的进化的等级是相同的。大肠杆菌为原核生物,在进化树的最低层,稍早于酵母的位置,所以与酵母的同源性最高,它们都在进化树的低层。而藻类和其他的高等植物在进化树的高层,所以它们之间同一个基因会出现这么大差别。由于海洋生存环境的原因,海带TPS基因(LjTPS)和其他海藻TPS基因可能是农作物抗旱耐盐遗传改良的优良基因源。将海藻TPS基因转入农作物有望在一定程度上提高作物的抗干旱、耐盐碱的能力,在农作物改良中具有良好的应用前景。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
0 引言  11-13
1 文献综述  13-34
  1.1 海藻概述与海带  13-19
    1.1.1 海藻生物学特征与应用  13-14
    1.1.2 海带研究概况  14-19
  1.2 分子标记技术及其应用  19-29
    1.2.1 遗传标记概述  19-20
    1.2.2 常用的分子标记  20-25
    1.2.3 分子标记的应用  25-27
    1.2.4 分子标记在海带等海藻研究中的应用  27-29
  1.3 海藻糖合成酶基因概况  29-34
    1.3.1 海藻糖概述  30-32
    1.3.2 海藻糖合成酶基因研究  32-34
2 海带EST-SSR标记开发与应用  34-54
  2.1 实验材料  34-35
    2.1.1 海带配子体材料  34
    2.1.2 主要仪器与试剂  34-35
  2.2 实验方法  35-40
    2.2.1 DNA的提取与检测  35-36
    2.2.2 EST序列获得  36
    2.2.3 SSR筛查  36
    2.2.4 EST-SSR引物的设计  36-37
    2.2.5 海带EST-SSR引物扩增条件的优化  37-38
    2.2.6 EST-SSR扩增分析  38
    2.2.7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳  38-40
    2.2.8 数据统计及分析  40
  2.3 结果分析  40-51
    2.3.1 海带配子体DNA提取与检测  40-41
    2.3.2 海带EST获取  41
    2.3.3 海带EST中微卫星序列数量和分布  41-44
    2.3.4 EST-SSR 引物设计  44-46
    2.3.5 EST-SSR 引物扩增与遗传多样性分析  46-51
  2.4 讨论  51-54
    2.4.1 海带DNA的提取  51
    2.4.2 EST-SSR引物设计  51-52
    2.4.3 EST-SSR验证与反应条件优化  52
    2.4.4 海带EST-SSR通用性及遗传多样性分析  52-54
3 海藻TPS基因克隆和比较遗传学研究  54-75
  3.1 海藻TPS基因克隆  54-67
    3.1.1 实验材料  54-55
    3.1.2 实验方法  55-58
    3.1.3 结果  58-67
  3.2 多种藻类TPS基因的比较分析  67-73
    3.2.1 海藻TPS的比较分析  67-68
    3.2.2 海藻TPS基因与其他物种的TPS基因的比较  68-69
    3.2.3 海藻TPS基因(G+C)含量与其他物种的TPS基因(G+C)含量的比较  69-70
    3.2.4 海藻TPS功能域预测和二级结构分析  70-73
  3.3 讨论  73-75
4 结论  75-76
参考文献  76-81
附录  81-82
致谢  82-83

海带EST-SSR标记开发及TPS基因的克隆和比较遗传学研究

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