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高山被孢霉△6脂肪酸脱饱和酶基因的克隆及表达分析

作　者: 刘建民
导　师: 余龙江；栗茂腾
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化工
关键词: 高山被孢霉 γ-亚麻酸基因克隆表达分析
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 122次
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内容摘要

γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid,GLA)属于n-6系列多不饱和脂肪酸,是合成前列腺素E1和E2的前体,在维持人的正常生理功能中起着重要作用。高山被孢霉是花生四烯酸高产菌株,在其生物合成途径中含有γ-亚麻酸合成的关键酶-△6脂肪酸脱饱和酶。本文利用高山被孢霉W15为材料,克隆了△6脂肪酸脱饱和酶基因全长和△6脂肪酸脱饱和酶的cDNA序列,并对克隆的△6脂肪酸脱饱和酶基因进行了表达分析。△6脂肪酸脱饱和酶基因的全长为2202bp,该序列长度在高山被孢霉中是国内外最新报道,与已报道的序列同源性最高达99%;结构分析表明,该序列含有两个内含子,分别处于17-229bp和410-1024bp位置。以高山被孢霉W15 RNA为模板,通过RT-PCR扩增出可能的△6脂肪酸脱饱和酶基因,该基因全长为1374bp,推导的蛋白质序列编码457个氨基酸,与报道的高山被孢霉△6脂肪酸脱饱和酶基因的同源性达到95%,其编码的蛋白质N端具有典型的细胞色素b5结构域。将该可能的△6脂肪酸脱饱和酶基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,通过电穿孔法转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,1%的甲醇诱导转化子表达外源基因,通过对转化子油脂的气相色谱分析,与γ-亚麻酸标准品做对照,有γ-亚麻酸峰的出现,证明插入的基因为△6脱饱和基因酶。△6脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与成功表达,为进一步筛选到高产γ-亚麻酸的菌种并应用于工业化生产,或转入油菜、大豆等油料作物中,以改变其脂肪酸组成,培育新型的作物品系提供前提和基础。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
1 绪论  7-18
  1.1 多不饱和脂肪酸研究进展  7-13
  1.2 γ-亚麻酸研究概况  13-15
  1.3 脂肪酸脱饱和酶及脱饱和酶基因研究进展  15-18
2 高山被孢霉△6 脂肪酸脱饱和酶基因的克隆及表达  18-31
  2.1 实验材料  18-20
  2.2 实验方法  20-31
3 结果与分析  31-43
  3.1 DNA 提取方案的优化  31-32
  3.2 高山被孢霉W15 △6 脂肪酸脱饱和酶全长基因的克隆  32-35
  3.3 高山被孢霉 W15 △6 脂肪酸脱饱和酶基因 cDNA 的克隆  35-38
  3.4 △6 脂肪酸脱饱和酶基因功能的验证  38-39
  3.5 △6 脂肪酸脱饱和酶基因内含子分析及系统进化分析  39-43
4 讨论  43-48
  4.1 引物设计  43-44
  4.2 RT-PCR 反应  44-45
  4.3 毕赤酵母表达系统的选择  45-46
  4.4 毕赤酵母感受态的制备与保存  46
  4.5 转化毕赤酵母  46
  4.6 △6 脂肪酸脱饱和酶基因的表达  46-48
5 结论与展望  48-50
  5.1 结论  48
  5.2 工作展望  48-50
致谢  50-51
参考文献  51-59
附录1 攻读硕士学位期间发表的论文目录  59-60

高山被孢霉△6脂肪酸脱饱和酶基因的克隆及表达分析

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