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分枝杆菌同源膜锚定表达载体的构建与细胞定位分析

作　者: 王鑫
导　师: 朱越雄；范小勇
学　校: 苏州大学
专　业: 微生物学
关键词: 启动子 pfurAma 穿梭表达载体分枝杆菌膜分泌信号肽绿色荧光蛋白膜锚定表达载体细胞定位
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病(tuberculosis)的病原菌,而卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)是全球公认的唯一有效的结核疫苗。通过表达某些重要保护性抗原编码基因来构建重组卡介苗(recombinant bacillus Calmette-Guérin,rBCG)是改进结核疫苗效力的重要方法之一。通常情况下,构建的rBCG将抗原分泌至胞外或锚定于细胞外膜表面,可更为有效地递呈并产生免疫反应。目的:比较结核分枝杆菌(M. tb)突变型启动子pfurAma的突变体pfurAma-N和pfurAma-N3以及phsp60控制基因表达的活性,用以构建分枝杆菌膜锚定表达载体,并分析外源目的蛋白的表达情况及其亚细胞定位分析。方法:PCR扩增启动子pfurAma突变体,并在其5’端额外引入NdeⅠ酶切位点以便于信号序列或标签分子的克隆,并将导致的pfurAma-N(pfurAma启动子起始密码子上游-3~-1位AGT→CAT突变)和pfurAma-N3(pfurAma启动子起始密码子上游-1位增加三个密码子CAT)分别亚克隆入探针载体pMC210,以pfurAma和phsp60启动子重组报告质粒分别电转化耻垢分枝杆菌mc2155,通过检测胞外β-半乳糖苷酶活性评估启动子活性。然后选取最强的启动子pfurAma-N取代pMV261载体中的phsp60启动子,从而构建胞内表达载体pMFA42。随后,人工合成带有NdeⅠ和BamHⅠ粘性末端的结核分枝杆菌19 kDa抗原膜结合信号序列的正义链和反义链,退火后将其直接亚克隆至pMFA42载体中构建膜锚定表达载体pMFA42M。PCR扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因,分别亚克隆至上述两种不同类型的载体中并电转化耻垢分枝杆菌(M.s),分别获得重组EGFP融合胞内表达菌株和膜锚定表达菌株;接着,将M. tb主要保护性抗原Ag85A及其嵌合抗原Ag856A2的编码基因亚克隆入膜锚定表达载体pMFA42M中构建M. tb抗原-EGFP融合表达菌株;通过Western-blot和流式细胞表面标记技术来分析目的抗原的表达水平及其亚细胞定位,并进一步通过荧光显微镜直接观察重组EGFP融合表达菌株在体外和感染巨噬细胞后的荧光强度。结果:成功扩增出启动子突变体pfurAma-N和pfurAma-N3,启动子活性分析发现pfurAma启动子起始密码子上游三位密码子的突变并不影响启动子活性,pfurAma-N与pfurAma活性相当,均为phsp60活性的2倍左右;而增加启动子和起始密码间的距离则将导致其活性显著下降,pfurAma-N3活性仅为phsp60的一半。通过引入M. tb 19 kDa脂蛋白膜分泌信号,在高效的启动子pfurAma-N的驱动下,成功地构建了分枝杆菌膜锚定表达载体。利用EGFP作为标签抗原,通过Western-blot、荧光显微观察和流式细胞表面标记等技术均证实了外源目的抗原可在分枝杆菌中高水平表达并定位至细胞膜上。结论:本研究为重组BCG和分枝杆菌膜蛋白功能研究提供了一种新型的膜锚定表达载体,所构建的EGFP重组表达菌株亦可作为一种模式示踪菌为细胞吞噬和动物免疫中的细菌定植和移位分析提供新的思路。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
第一部分文献综述  10-20
  第一章重组卡介苗的研究进展  11-20
    1 卡介苗简介  11-12
    2 重组卡介苗的问世  12-13
    3 重组卡介苗应用载体介绍  13-19
      3.1 构建重组卡介苗载体的启动子  14-16
      3.2 分泌表达载体  16-19
    4 未来研究趋势  19-20
第二部分研究报告  20-50
  第二章研究目的与内容  21-24
    1 研究目的及意义  21
    2 研究策略与内容  21-22
      2.1 分析新型启动子活性  21-22
      2.2 膜锚定表达载体的构建与细胞定位分析  22
    3 技术路线  22-24
  第三章分枝杆菌新型启动子活性分析  24-36
    1 引言  24-25
    2 材料与方法  25-30
      2.1 材料  25-26
      2.2 方法  26-30
    3 结果与分析  30-33
      3.1 启动子突变体pfurAma-N 和pfurAma-N3 的PCR 扩增  30-31
      3.2 启动子基因的亚克隆与酶切鉴定  31-32
      3.3 启动子活性的比较  32-33
    4 讨论  33-35
    5 小结  35-36
  第四章膜锚定表达载体的构建与细胞定位  36-50
    1 引言  36-37
    2 材料与方法  37-42
      2.1 材料  37-38
      2.2 方法  38-42
    3 结果  42-47
      3.1 分枝杆菌膜锚定表达载体的构建  42-43
      3.2 EGFP 标签融合表达载体的构建  43-44
      3.3 重组膜锚定融合表达载体pMFA42MAG 和pMFA42MA2G 的构建  44-45
      3.4 Western-blot 分析目的蛋白的表达情况及其亚细胞定位  45
      3.5 荧光显微观察重组菌的体外和感染巨噬细胞后的EGFP 表达情况  45-46
      3.6 流式细胞术分析目的蛋白的亚细胞定位  46-47
    4 讨论  47-49
    5 小结  49-50
参考文献  50-55
结论  55-57
  1 已取得的成果  55-56
  2 有待进行的研究  56-57
附录一：缩略词中英文对照表  57-59
附录二：实验中使用的部分载体结构图  59-63
附录三攻硕期间科研情况  63-64
  1 研究课题  63
  2 发表论文  63-64
致谢  64-65

分枝杆菌同源膜锚定表达载体的构建与细胞定位分析

内容摘要

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