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（R）-羟基苯乙酮还原酶与甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达

作　者: 孙莹
导　师: 徐岩
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 羟基苯乙酮还原酶 甲酸脱氢酶 共表达 辅酶再生 不对称还原
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 137次
引　用: 3次
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内容摘要


生物催化的不对称还原反应中,辅酶不能循环使用是限制其工业化应用的“瓶颈”因素。全细胞可以通过自身代谢为反应提供一定量的辅酶,但按照化学当量平衡,当底物浓度提高,反应所需的辅酶量增加时,辅酶的供给就成为主要的限制因素。本文根据大肠杆菌对密码子的偏好性,对近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)-羟基苯乙酮还原酶基因rcr进行了密码子优化。用PCR的方法从博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)基因组中扩增出甲酸脱氢酶基因fdh,将两个基因克隆构建到共表达载体pETDuetTM-1后,转化稀有密码子优化型菌株E. coli Rosetta,实现了(R)-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶基因的高效共表达。以高浓度(5 g/L)的2-羟基苯乙酮和适量的甲酸钠为底物,0.1 g重组菌细胞催化产生(R)-苯基乙二醇,进行了不对称还原反应条件的选择,为基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础。主要研究结果包括:(1)以实验室保藏的C. parapsilosis基因组为模板,根据(R)-羟基苯乙酮还原酶基因序列和大肠杆菌密码子的偏好性,设计引物Rcr-F1和Rcr-R1,Rcr-F2和Rcr-R2,以及Rcr-F3和Rcr-R2,用PCR的方法扩增出目的基因rcr的前半段(约800 bp)和后半段(约200 bp),然后用重叠延伸PCR(splicing overlapping extension-PCR , SOE-PCR)的方法连接两段基因获得密码子优化后的全长基因rcr。将rcr克隆到pMD19-T载体中,获得重组质粒T-rcr,测序结果表明rcr序列全长为1011 bp,编码336个氨基酸。(2)以实验室保藏的C. boidinii基因组为模板,根据已报道的C. boidinii的fdh基因序列(Accession No. AJ011046),利用DNAMAN软件设计引物Fdh-F和Fdh-R,PCR法扩增出基因fdh后连接到pMD19-T载体中,获得重组质粒T-fdh,测序结果表明rcr基因全长为1095 bp,编码364个氨基酸。(3)将rcr与fdh基因同时构建到共表达质粒pETDuetTM-1中,获得重组质粒pETDuet-rcr-fdh。将重组表达质粒转化密码子优化型菌株E. coli Rosseta,获得(R)-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶基因的共表达阳性克隆。经30℃,1 mmol/L IPTG诱导8 h,SDS-PAGE结果表明(R)-羟基苯乙酮还原酶和甲酸脱氢酶均有明显表达,其相对分子质量分别为37 kDa和40 kDa。通过摇瓶条件的研究,确定了重组蛋白的最佳诱导条件为:250 mL的三角瓶中装液量20%,培养液的OD600值为0.8开始诱导,诱导温度为30℃,IPTG的浓度为0.8 mmol/L,诱导16 h结束培养。由于引物设计时插入了6×His标签,因而通过Ni2+离子柱亲和层析一步纯化,同时获得了较纯的两种酶蛋白。(4)对重组菌全细胞催化2-羟基苯乙酮不对称还原反应的条件进行了选择,结果表明当底物2-羟基苯乙酮浓度为5 g/L,细胞浓度为10%时,选择最适pH 7.0,最适反应温度35℃,反应时间36 h,产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度达到100% e.e.,产率可达74.0%。通过优化反应体系中辅助底物甲酸钠的浓度,并添加适量的ZnSO4,可使产物(R)-苯基乙二醇的光学纯度和产率分别达到100% e.e.和85.9%。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章 绪论  8-17
  1.1 立题意义  8-9
  1.2 国内外研究进展  9-14
    1.2.1 生物法制备光学纯苯基乙二醇的研究现状  9
    1.2.2 利用重组菌合成手性化合物研究进展  9-11
    1.2.3 辅酶再生的策略  11-12
    1.2.4 基因的优化表达  12-14
  1.3 本课题研究思路和内容  14-17
    1.3.1 课题研究思路  14
    1.3.2 研究方法  14-16
    1.3.3 研究内容  16-17
第二章 密码子优化的(R)-羟基苯乙酮还原酶与甲酸脱氢酶基因的克隆及共表达载体的构建  17-30
  2.1 前言  17
  2.2 材料  17-19
    2.2.1 菌株与质粒  17-18
    2.2.2 主要试剂  18
    2.2.3 培养基与溶液  18-19
    2.2.4 主要仪器  19
  2.3 实验方法  19-26
  2.4 结果与讨论  26-29
    2.4.1 近平滑假丝酵母和博伊丁假丝酵母基因组DNA 的获得  26
    2.4.2 PCR 扩增产物的电泳鉴定  26
    2.4.3 T-rcr、T-fdh 克隆测序质粒的构建与酶切鉴定  26-27
    2.4.4 rcr 和fdh 基因序列  27-28
    2.4.5 共表达载体pETDuet-rcr-fdh 的构建  28-29
  2.5 本章小结  29-30
第三章 密码子优化的(R)-羟基苯乙酮还原酶与甲酸脱氢酶共表达的研究及初步纯化  30-41
  3.1 前言  30
  3.2 材料  30-32
    3.2.1 菌株与质粒  30
    3.2.2 主要试剂  30-31
    3.2.3 培养基与溶液  31
    3.2.4 主要仪器  31-32
  3.3 实验方法  32-34
  3.4 结果与讨论  34-40
    3.4.1 质粒pETDuet-rcr-fdh 转化表达菌株E. coli BL21 的结果分析  34-35
    3.4.2 质粒pETDuet-rcr-fdh 转化表达菌株E. coli Rosetta 的结果分析  35-36
    3.4.3 共表达条件的选择优化  36-40
  3.5 本章小结  40-41
第四章 重组菌生物转化条件的优化研究  41-51
  4.1 前言  41
  4.2 材料  41
    4.2.1 菌株与质粒  41
    4.2.2 主要试剂  41
    4.2.3 主要仪器  41
  4.3 实验方法  41-43
    4.3.1 反应体系中底物2-羟基苯乙酮浓度的选择  41-42
    4.3.2 反应体系中细胞浓度的选择  42
    4.3.3 反应体系缓冲pH 值的选择  42
    4.3.4 反应温度的选择  42
    4.3.5 反应时间的选择  42
    4.3.6 反应体系中细胞状态的选择  42
    4.3.7 辅助底物甲酸钠的添加量优化  42
    4.3.8 Zn~(2+)对重组菌不对称还原反应的影响  42-43
  4.4 结果与讨论  43-48
  4.5 本章小结  48-51
致谢  51-53
参考文献  53-57
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文  57

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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