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家蚕生物钟基因Cry的克隆和功能鉴定

作　者: 梁辉
导　师: 徐世清；司马杨虎
学　校: 苏州大学
专　业: 发育生物学
关键词: 家蚕 Cry基因基因克隆近日节律组织定位
分类号: S881.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

生物钟是昆虫周期性生命活动的重要调控机制,其通过光照、温度、季节变化等因素直接影响生命体的节律行为,其中光照和温度是最重要的授时因子。昆虫中生物钟的分子机制研究主要是集中在果蝇中,而其他非果蝇类的昆虫中研究的较少。家蚕是鳞翅目模式昆虫,其自身的诸多优点决定了其作为研究生物钟模型的优良模型,在我们的试验中主要研究两种类型的生物钟基因Cry,即果蝇同源性的Cryptochrome(Cry),即为Cry1,和脊椎动物同源性的Cryptochrome(Cry),即为Cry2。本试验首先通过试验克隆,获得了家蚕生物钟基因Cry1和Cry2,调查了Cry1和Cry2基因在家蚕的不同组织和发育时期特异的表达;并且调查了Cry1和Cry2基因在家蚕成虫期不同组织中不同光节律和温节律下的振荡表达;同时,在卵期采用不同的滞育诱发环境来调查Cry1和Cry2基因对环境因子的响应;最后通过制备多克隆抗体,对CRY1和CRY2在家蚕成虫脑部的组织特异表达进行组织定位;为CRY1和CRY2的功能研究提供了线索和证据。通过试验研究主要得到以下结果:通过拼接试验克隆产物及5’和3’RACE产物后,分别获得了家蚕Cry1和Cry2基因的全长cDNA,分别为2.166kb和2.389kb。将全长cDNA在NCBI的数据库中比对,序列与数据库中比对结果完全一致,并且5’和3’均符合5’和3’UTR结构特征,可以确定获得了全长cDNA。对不同发育时期和不同组织以及芯片表达谱调查显示,Cry1和Cry2基因的表达具有组织和发育时期的特异性,Cry1和Cry2基因在家蚕蛾期的表达量高于其它发育时期,在家蚕蛾的头和触角中的表达量高于四肢和飞行肌。免疫组化结果表明,CRY1和CRY2蛋白质集中在家蚕蛾脑部的前脑叶高量表达,并且具有组织细胞分布的特异性;蚕蛾前脑叶的主要功能是与视觉形成和感受外界环境变化有关,因此推测CRY1和CRY2具有生物钟环路中转换环境授时因子变化的作用。在家蚕蛾期,采用经典的光制和温制的振荡节律处理,利用Real-time PCR的方法调查Cry1和Cry2基因的节律振荡表达,结果显示Cry1和Cry2基因在家蚕成虫期头部的表达呈现振荡节律变化,并且在相同光制中Cry1和Cry2基因的变化趋势非常的一致,变化波形几乎相同,但表达量有差别。推测Cry1和Cry2基因在家蚕生物钟环路中处于相同环路中,可能是相关联基因。在不同温制下,Cry1和Cry2基因的表达出现了显著的相位位移和波形变化,推知Cry基因在响应温度节律的机制中也发挥着重要的作用,但在定量分析结果中找不到Cry1基因和Cry2基因对温度节律的相关性变化,推测Cry1基因和Cry2基因在温度调节生物钟变化的机制中处于不同的环路中。通过采用常规诱导滞育发生的温度与光照条件处理胚胎发育后期蚕卵,调查家蚕胚胎生物钟信号环路主要基因Cry1和Cry2的表达对授时因子振荡变化的响应。结果显示,光照能够上调Cry1基因在家蚕胚胎发育后期的表达,温度则可改变该基因的振荡周期相位;温度在改变Cry2基因振荡表达相位的同时低温(15℃)还能够上调该基因在家蚕胚胎发育后期的表达,提示家蚕胚胎中可能存在与其他昆虫类似的以CRY1为光感受器的生物钟环路,为我们研究家蚕滞育发生与生物钟的关系提供了一定的线索。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-12
第一章文献综述  12-31
  1 生物钟的概念  12-14
  2 授时因子  14-15
    2.1 光照授时因子  14-15
    2.2 温度授时因子  15
    2.3 饮食授时因子  15
    2.4 磁场授时因子  15
  3 生物钟基因  15-19
    3.1 周期蛋白基因  16
    3.2 永恒蛋白基因  16-17
    3.3 隐花色素基因  17-18
    3.4 类脑和肌肉芳香烃受体核转位子基因  18
    3.5 时钟蛋白基因  18
    3.6 双时蛋白基因  18-19
    3.7 旋转蛋白基因  19
  4 生物钟分子调控信号途径  19-23
    4.1 果蝇的生物钟环路  19-20
    4.2 哺乳动物的生物钟环路  20-21
    4.3 昆虫的生物钟新环路  21-23
    4.4 生物钟基因网络作用环路的综合  23
  5 昆虫生物钟研究现状  23-28
    5.1 昆虫生物钟基因的进化  24-25
    5.2 昆虫生物钟基因在脑部的定位  25-28
  6 家蚕是研究温度授时作用生物钟环路的优良实验动物  28-29
  7 生物钟研究的前景  29-31
第二章基本实验方法  31-46
  1 常用材料与试剂  31-34
    1.1 家蚕品种与大肠杆菌菌种  31
    1.2 主要试剂  31-32
    1.3 培养基  32
    1.4 缓冲液和常用溶液  32-33
    1.5 核酸电泳相关试剂  33
    1.6 生物信息学资源及分析软件  33-34
  2 主要仪器设备  34
  3 基本实验方法  34-46
    3.1 总RNA 的抽提  34-35
    3.2 cDNA 第一条链的合成  35
    3.3 PCR 扩增反应程序及加样体系  35-36
    3.4 实时定量PCR（Real time PCR）  36
    3.5 PCR 产物的回收  36
    3.6 连接反应  36
    3.7 感受态细胞制备  36
    3.8 连接产物的转化  36-37
    3.9 重组质粒的筛选  37
    3.10 碱裂解法少量制备质粒DNA  37
    3.11 酶切反应  37
    3.12 利用5’-Full RACE Kit 扩增5'cDNA 末端（5’RACE）  37
    3.13 3’RACE 扩增3'cDNA 末端结构  37-38
    3.14 多克隆抗体的制备  38-41
    3.15 石蜡切片的制备方法  41-43
    3.16 免疫组化步骤  43-46
第三章家蚕Cry1 和Cry2 基因的克隆与分析  46-55
  1 材料与方法  46-48
    1.1 试验材料  46
    1.2 主要试剂  46
    1.3 总RNA 提取  46
    1.4 克隆ORF 第一条cDNA 链合成  46
    1.5 5’RACE 和3’RACE PCR cDNA 制备  46-47
    1.6 基因克隆引物设计  47-48
    1.7 PCR 反应体系及条件设置  48
    1.8 Cry1/Cry2 基因的电子表达谱分析  48
    1.9 生物钟基因Cry1/Cry2 的组织表达分析  48
  2 结果与分析  48-53
    2.1 RT-PCR 反应及RACE 酶切鉴定  48-51
    2.2 Cry1/Cry2 基因的电子表达谱分析  51-52
    2.3 生物钟基因Cry1/Cry2 的组织表达分析  52-53
  3 讨论  53-55
    3.1 家蚕中存在两种类型的Cry 基因  53
    3.2 Cry1/Cry2 的表达具有组织特异性  53-54
    3.3 Cry1/Cry2 的表达具有发育时期的特异性  54-55
第四章诱发滞育的温度和光照条件对家蚕胚胎生物钟信号主要基因表达的影响  55-65
  1 材料与方法  55-57
    1.1 供试蚕卵及处理方法  55-56
    1.2 蚕卵样品总RNA 的提取及cDNA 第1 条链的合成  56
    1.3 基因表达谱分析  56-57
  2 结果与分析  57-62
    2.1 家蚕胚胎发育后期Cry1 基因表达对温度与光照授时因子变化的响应  57-59
    2.2 家蚕胚胎发育后期Cry2 基因表达对温度与光照授时因子变化的响应  59-60
    2.3 家蚕胚胎发育后期Per 基因表达对温度与光照授时因子变化的响应  60-61
    2.4 家蚕胚胎发育后期Tim 基因表达对温度与光照授时因子变化的响应  61-62
  3 讨论  62-65
    3.1 家蚕Cry1、Cry2、Per 和Tim 基因是胚胎期的生物钟基因  62-63
    3.2 滞育诱导光周期是家蚕胚胎发育后期昼夜节律的有效授时因子  63
    3.3 温度是影响家蚕生物钟的重要授时因子  63-64
    3.4 利用家蚕研究生物钟的温度与光照授时因子作用机制具有独特优势  64-65
第五章温度和光节律对家蚕成虫生物钟基因Cry1 和Cry2 表达的影响  65-79
  第一节温度和光节律对家蚕成虫生物钟基因Cry1 和Cry2 表达的竞争性PCR 分析  65-71
    1. 试验材料与方法  65-66
      1.1 供试家蚕为家蚕C108  65-66
      1.2 总RNA 的提取及cDNA 第1 条链的合成  66
      1.3 基因表达谱分析  66
    2 结果与分析  66-71
      2.1 Cry 基因在不同的光节律下的节律变化  66-69
      2.2 Cry 在不同的温度节律下的变化  69-71
  第二节温度和光节律对家蚕生物钟基因Cry1 和Cry2 定量分析  71-77
    1 材料与方法  71-72
      1.1 试验材料与处理方法  71
      1.2 总RNA 的提取及cDNA 第1 条链的合成  71
      1.3 基因表达谱分析  71-72
      1.4 数据处理方法  72
    2 结果分析  72-77
      2.1 不同的光节律下Cry 基因的定量分析  72-75
      2.2 不同温度节律对家蚕生物钟基因Cry1 和Cry2 表达影响的定量分析  75-77
  第三节本章讨论  77-79
    1 家蚕蛾期生物钟的核心振荡器中Cry1 对光节律做出了响应，是核心生物钟的重要成员  77
    2 Cry1 基因在蚕蛾头部温度节律的调节中发挥着重要的作用，是温度调节的关键基因  77-78
    3 Cry2 在蛾期的光节律调控的核心振荡器中发挥着重要的作用，可能是Cry1 调节的下游基因，或者是相关联基因  78
    4 Cry2 基因是温度周期调控中的核心基因，在对温度的响应中发挥着重要的作用  78
    5 Cry1 和Cry2 对温周期的调控可能处于不同调节环路  78-79
第六章 CRY1 和CRY2 的组织定位  79-88
  第一节多克隆抗体制备  79-82
    1 材料与方法  79-81
      1.1 试验动物的准备  79
      1.2 抗原制备  79
      1.3 抗体效价测定试剂配制  79-80
      1.4 CRY1 和CRY2 多克隆抗体的制备步骤  80
      1.5 抗体效价测定ELISA 检测操作步骤  80-81
    2 结果分析  81-82
      2.1 CRY1 与CRY2 抗原的纯度分析测定结果  81-82
      2.2 抗体效价  82
  第二节 CRY1 和CRY2 的组织表达定位  82-87
    1 试验动物及处理方法  82-83
      1.1 试验动物  82
      1.2 处理方法和取材  82-83
      1.3 组织的固定  83
      1.4 组织切片的准备步骤  83
      1.5 免疫组化方法  83
    2 结果与分析  83-87
      2.1 家蚕蛾头部的组织形态鉴定  83-84
      2.2 CRY1 的组织表达定位  84-85
      2.3 CRY2 的组织表达定位  85-87
  第三节本章讨论  87-88
    1 采用化学偶联合成抗原制备多克隆抗体方法可靠，得到了效价较高的 CRY1 和 CRY抗体  87
    2 CRY1 蛋白主要分布在前脑区  87
    3 CRY2 蛋白主要分布在前脑区的特异性组织细胞  87-88
第七章综合结论  88-91
  1 家蚕中存在两种类型的Cry 基因，并且具有组织和发育时期的差异性  88
  2 Cry 基因是家蚕胚胎发育后期重要的生物钟基因，可能是调控家蚕滞育发生环路的重要基因  88-89
  3 Cry 基因是生物钟调节环路转换光信号的核心基因  89
  4 Cry 基因在生物钟环路中调节中对温度的信号转换起着重要的作用  89
  5 CRY1 和CRY2 在家蚕脑部神经集中的部位表达量较高  89-90
  6 进一步研究方向  90-91
参考文献  91-98
研究生期间发表文章  98-99
研究生期间登录的基因  99-100
论文资助项目  100-101
附录  101-105
致谢  105-106

家蚕生物钟基因Cry的克隆和功能鉴定

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