学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

绿僵菌磷酸甘露糖异构酶基因的克隆及功能分析

作　者: 李敏
导　师: 曹月青
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: 绿僵菌 pmi基因 RNA干扰致病性逆境耐受性
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 32次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

昆虫病原真菌绿僵菌(Metarhizium acridum)是一类重要的生防微生物。国内外对其致病机理进行了大量的研究,主要集中在侵染期、侵入期和产孢期。其中侵入期即绿僵菌侵入寄主血腔,定殖、适应血淋巴这个阶段的研究对于真菌致病性的研究具有重要意义。我们课题组构建了绿僵菌侵入蝗虫体内阶段cDNA差减文库,在此基础上,经过分析比对,我们选择了长度分别为320 bp的EST片段。这个基因编码的蛋白质同其他真菌中的磷酸甘露糖异构酶有很高的同源性,通过cDNA文库筛选,获取其编码框;通过基因组步移法获得其DNA全长。利用RNAi的方法研究了磷酸甘露糖异构酶(Mapmi)的功能。主要研究结果如下:①获取了Mapmi基因的ORF和DNA全长,并进行了相关的生物信息学分析。Mapmi基因的ORF为1326bp,其Genbank登录号为HQ123439。预测该基因编码441个氨基酸。利用其ORF与绿僵菌基因组数据库比对分析,获得该基因的基因组DNA全长为1386bp。利用DNAMAN软件对DNA序列和ORF序列比对分析,结果表明,含有两个外显子和一个60bp的内含子,内含子位于距离起始密码145bp处,具有典型的GT….AG边界。通过网上软件预测该基因的分子量为47.65kDa,等电点为5.31,利用SignalP分析发现无信号肽。②采用RNAi的方法抑制其转录水平来初步确定Mapmi基因可能具有的功能。构建RNAi干扰载体pK2-RNAi-Mapmi,通过农杆菌介导的转化方法转化绿僵菌CQMa102,并用PCR方法验证提取的绿僵菌基因组,选取10个Mapmi基因的转化子,并通过定量PCR测定Mapmi基因在干扰突变株和野生菌株中的表达差异。测定结果分析,干扰突变株Mapmi基因表达被抑制后,干扰效率在42.5%-89.8%之间。③我们观察了Mapmi基因突变菌株在含有各类不同的细胞胁迫剂的PDA培养基上的生长及其形态。实验结果发现,干扰菌株在含有CR、KCl和H2O2的培养基上生长明显受到抑制;在加了KCl的培养基中的生长受抑制程度最大。在不加任何东西的固体PDA培养基上,干扰型生长速度和野生型相差不显著。野生型在各类培养基上生长正常。④分析了Mapmi基因干扰菌株在不同碳源培养基上的生长情况。干扰菌株和野生菌株的孢悬液分别接种于以葡萄糖或果糖为唯一碳源的培养基上培养,结果表明,与野生型相比,干扰株的生长明显受到抑制;将干扰菌株和野生菌株的孢悬液分别接种于不同浓度的甘露糖(0.003、3、30、300、420mM)为唯一碳源培养基上,结果表明,在体外补加的甘露糖浓度较低(0.003mM)和较高(420mM)的情况下,野生株和干扰株的生长都会受到影响,但是干扰株受的影响较大。而在3mM和30mM时,干扰型突变株生长回复。⑤测定Mapmi基因的干扰突变株在含有细胞胁迫剂的1/4SDA培养液中的菌丝干重即生物量。结果分析表明,在含有CR、KCl和H2O2的培养基上收集的生物量显著低于野生型,而在原始的1/4SDAY培养液里,干扰菌株与野生型相比,生物量差异不显著。⑥对Mapmi基因干扰菌株在PDA培养基及添加各种细胞胁迫剂情况的萌发率及产孢量的测定。干扰菌株和野生菌株的孢悬液分别接种于固体PDA培养上,定时测定其萌发率和产孢量。结果表明,干扰菌株在含有CR、KCl和H2O2的培养基上的萌发率和产孢量与野生型菌株的相比显著降低。⑦对Mapmi基因的干扰突变株进行了生物学毒力测定,采用体表侵染的生物测定方式点滴到蝗虫的前胸背板处,结果显示Mapmi基因被干扰后,菌株对蝗虫的致死时间延迟一天以上,干扰突变株的毒力显著降低。说明Mapmi基因影响菌株毒力。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-9
缩略词  9-10
1 绪论  10-17
  1.1 引言  10-11
  1.2 绿僵菌研究背景及致病相关基因的研究进展  11-12
  1.3 绿僵菌Mapmi 基因研究背景及进展  12
  1.4 RNA 干扰技术在病原真菌基因功能研究中的应用进展  12-13
  1.5 根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的应用进展  13-14
  1.6 立题依据和研究目标  14-15
  1.7 研究内容  15
  1.8 技术路线  15
  1.9 本研究创新之处  15-17
2 材料与方法  17-30
  2.1 材料  17-19
    2.1.1 所用菌株和昆虫  17
    2.1.2 主要实验仪器  17-18
    2.1.3 主要试剂  18
    2.1.4 主要培养基及溶液  18-19
  2.2 绿僵菌 Mapmi 基因cDNA 序列的克隆  19-21
    2.2.1 引物的设计  19
    2.2.2 绿僵菌侵染血淋巴时期的全长均一化cDNA 文库质粒的获得  19
    2.2.3 绿僵菌Mapmi 基因cDNA 序列的克隆  19-21
  2.3 绿僵菌Mapmi 基因DNA 全长的获取  21
  2.4 生物信息学分析  21
  2.5 Mapmi 基因的干扰  21-29
    2.5.1 扩增及酶切目标基因干扰片段  22-24
    2.5.2 双酶切干扰中间载体载体（pDPB）  24
    2.5.3 干扰中间载体与Mapmi 基因干扰片段的连接  24
    2.5.4 连接后的载体pDPB-Mapmi 的克隆  24
    2.5.5 双酶切构建好的干扰中间载体载体（pDPB-Mapmi）和pK2 载体  24-25
    2.5.6 酶切的干扰pDPB-Mapmi 载体与pK2 干扰载体的连接  25
    2.5.7 连接后的载体 pK2-RNAi-Mapmi 的克隆  25
    2.5.8 转化农杆菌  25
    2.5.9 筛选农杆菌阳性克隆  25-26
    2.5.10 转化绿僵菌  26-27
    2.5.11 荧光定量PCR 技术检测干扰突变菌株的RNA 干扰效率  27-28
    2.5.12 干扰突变株性状分析  28-29
  2.6 数据分析  29-30
3 结果和分析  30-40
  3.1 Mapmi 基因的cDNA 序列的获取和DNA 全长的获取  30-32
    3.1.1 Mapmi 基因cDNA 序列的扩增  30
    3.1.2 Mapmi 基因DNA 序列的获取  30
    3.1.3 生物信息学分析结果  30-32
  3.2 Mapmi 基因RNA 干扰分析  32-40
    3.2.1 RNA 干扰效率的检测  33-34
    3.2.2 RNA 干扰突变株表型分析  34-36
    3.2.3 Mapmi 基因干扰突变株和野生株生物量测定  36-37
    3.2.4 干扰突变株和野生株萌发率及产孢量的测定  37-38
    3.2.5 干扰突变株和野生株室内生物学毒力测定  38-40
4 讨论  40-43
  4.1 丝状真菌基因功能研究的方法  40-41
    4.1.1 基因敲除( gene knockout)  40
    4.1.2 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）  40
    4.1.3 超表达（over-expression）  40-41
  4.2 Mapmi 基因影响真菌细胞壁完整性及真菌的毒力  41-43
5 结论与后续工作建议  43-45
致谢  45-46
参考文献  46-51
附录  51
  作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录  51

绿僵菌磷酸甘露糖异构酶基因的克隆及功能分析

内容摘要

全文目录

相似论文