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Sp1基因沉默对前列腺癌细胞CD59表达调控的作用研究

作　者: 梁岩
导　师: 高美华
学　校: 青岛大学
专　业: 免疫学
关键词: CD59 Sp1 启动子 补体 RNA干扰 前列腺癌
分类号: R737.25
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


研究背景：前列腺癌(carcinoma of prostate)在欧美发病率极高,近年来,随着人口老龄化、生活环境和饮食习惯的改变,前列腺癌在我国发病率呈明显上升趋势。前列腺癌大多为腺癌,常从前列腺的外周发生,最终经局部、淋巴和血行扩散转移。该肿瘤发病隐匿,早期很难察觉,分子生物学方面的研究已经成为发现、诊断、治疗该疾病的热点。CD59广泛分布于造血细胞及多种组织细胞表面,保护宿主细胞免受补体攻膜复合物((membrane attack complex, MAC)的攻击。近年来,国内外研究发现在多种实体肿瘤细胞中CD59分子高表达,推测可能与肿瘤的发生、发展有关,但其发生机制尚不明确。生物信息学分析,CD59启动子区域没有典型的TATA盒和CAAT盒,但富含GC盒,其中-35/-70的碱基序列是CD59启动子的关键部位,生物信息软件分析结果显示此部位正是转录因子Spl特异性地识别GC盒(GGGGCGGGG)的位点。Spl对GC盒有很强的亲和力,与许多靶基因的启动转录有关,在细胞增殖、凋亡、分化和肿瘤形成等过程中起非常重要的作用。研究发现,Spl高表达与胃癌、胰腺癌,前列腺癌的恶性程度呈止相关,与患者的生存期呈负相关,是影响患者预后的重要因素。因此,以Spl基因作为分子靶标,有望为肿瘤基因治疗开辟一条新途径。目的：构建针对Spl基因siRNA真核表达载体,转染前列腺癌细胞PC-3,研究反式作用因子Spl对CD59表达的调控作用。方法：应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性Spl基因的重组载体pSUPER-siSpl,经脂质体法转染前列腺癌PC-3细胞,G418筛选稳定表达转染该基因的阳性细胞克隆,荧光倒置显微镜下观察转染效率,RT-PCR及Western blot检测转染细胞中Spl和CD59基因的表达情况,流式细胞术检测CD59的表达,MTT及染料释放试验检测CD59基因抑制后肿瘤细胞对补体溶破的抵抗作用。结果：成功构建了Spl基因siRNA真核表达载体,转染PC-3细胞后,Spl和CD59基因mRNA表达量均明显降低,流式细胞仪检测CD59分子的表达减少,MTT和染料释放实验表明CD59基因受抑制后肿瘤细胞对补体溶破的抵抗作用降低。结论:siRNA-Spl重组载体有效地抑制了CD59的表达,降低CD59的抗补体活性,结果证明反式作用因子Spl是CD59表达调控中重要的转录因子,该研究为CD59在肿瘤细胞中高表达的分子机制提供了新思路,将为肿瘤基因靶向治疗开辟一条新途径。

全文目录


中文摘要  2-3
Abstract  3-8
引言  8-10
技术路线  10-11
第一章 Sp1基因RNA干扰真核表达载体的构建及鉴定  11-23
  1.1 材料  12-14
    1.1.1 主要仪器  12
    1.1.2 质粒、菌株  12
    1.1.3 主要实验试剂  12-13
    1.1.4 载体的选择  13-14
  1.2 方法  14-19
    1.2.1 RNA干扰片段的设计  14-15
    1.2.2 寡核苷酸链的退火  15
    1.2.3 pSUPER质粒的双酶切  15-16
    1.2.4 琼脂糖电泳分离大分子片段  16
    1.2.5 大分子片段的回收  16
    1.2.6 寡核苷酸与pSUPER载体的连接  16-17
    1.2.7 重组载体转化DH-5α感受态大肠杆菌(TSS法)  17
    1.2.8 高纯度质粒的制备  17-18
    1.2.9 重组质粒的鉴定  18-19
  1.3 结果  19-22
    1.3.1 pSUPER空质粒BglⅡ和Hind Ⅲ双酶切鉴定  19-20
    1.3.2 重组质粒的鉴定  20-22
      1.3.2.1 重组质粒的PCR鉴定  20
      1.3.2.2 重组质粒的酶切鉴定  20-21
      1.3.2.3 测序结果  21-22
  1.4 小结  22-23
第二章 pSUPER-siSp1转染PC-3细胞对SP1及CD59表达的抑制作用  23-37
  2.1 材料  25-27
    2.1.1 主要仪器  25
    2.1.2 细胞株  25
    2.1.3 主要实验试剂  25-27
  2.2 方法  27-32
    2.2.1 载体转染  27-29
    2.2.2 RT-PCR检测Sp1、CD59 mRNA表达  29-31
    2.2.3 Western blot检测Sp1、CD59蛋白表达  31-32
    2.2.4 流式细胞仪检测CD59的表达  32
    2.2.5 统计学方法  32
  2.3 结果  32-35
    2.3.1 PC-3细胞的培养  32-33
    2.3.2 重组载体转染效率的测定  33
    2.3.3 RT-PCR检测靶基因Sp1、CD59 mRNA相对表达水平的变化  33-34
    2.3.4 Western blot检测靶基因Sp1、CD59蛋白水平的变化  34-35
    2.3.5 流式细胞仪检测PC-3细胞中CD59基因的表达  35
  2.4 小结  35-37
第三章 Sp1基因沉默对前列腺癌细胞PC-3中CD59生物学行为的作用  37-41
  3.1 材料  37-38
  3.2 方法  38-39
    3.2.1 MTT  38
    3.2.2 LDH  38-39
  3.3 结果  39-40
    3.3.1 MTT法测定PC-3细胞在新鲜补体作用下的存活性  39
    3.3.2 染料释放试验结果  39
    3.2.3 统计学方法  39-40
  3.4 小结  40-41
讨论  41-42
结论  42-43
参考文献  43-45
综述  45-54
  参考文献  50-54
攻读硕士学位期间发表的论文  54-55
附录  55-61
  1. CD59启动子(-2255/+61)  55-56
  2. CD59启动子分析  56-59
  3. 重组质粒PCR鉴定序列  59-60
  4. 重组质粒pSUPER-siSp1测序  60-61
致谢  61-62

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 男性生殖器肿瘤 > 前列腺肿瘤
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