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飞蝗几丁质酶基因的功能研究

作　者: 李大琪
导　师: 张建珍；孙毅
学　校: 山西大学
专　业: 动物学
关键词: 飞蝗几丁质酶基因 RNA干扰转基因作物
分类号: S433.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

昆虫几丁质酶是个庞大的家族,不同几丁质酶的生物学功能存在较大差异。通过几丁质酶家族基因的时空表达特性及其在飞蝗发育中的生物学功能研究,筛选出对飞蝗致死性的几丁质酶基因。采用转基因技术培育表达dsRNA的玉米,初步探索基于RNAi的害虫防治方法。主要内容如下：一、飞蝗几丁质酶基因片段的获得及表达特性分析。搜索飞蝗EST数据库,采用生物信息学方法进行序列分析,共获得7条几丁质酶基因片段；以飞蝗每个龄期第4天蝗蝻整虫以及5龄第4天蝗蝻不同组织部位为材料提取RNA并反转录为cDNA,以此为模板研究飞蝗几丁质酶基因的时空表达特性。采用的研究方法为RT-PCR,结果表明7个几丁质酶基因的时空表达存在明显差异,其中LmCht10主要在表皮表达。二、飞蝗几丁质酶基因10 (LmCht10)的序列特征及时空表达。基于上述研究结果,采用简并引物及RACE-PCR等技术对LmCht10的全长序列进行克隆,共获得cDNA序列9815bp,其中开放阅读框8658bp,编码2886个氨基酸,3’非编码区序列为1157bp。2886个氨基酸序列中包含5个几丁质酶催化区与6个几丁质结合区。与己知昆虫Cht10的全序列比对分析,其5’端缺失约600 bp。以5龄每一天的飞蝗cDNA为模板,研究LmCht10在5龄飞蝗的发育变化图谱,结果发现LmCht10在5龄第6天达到表达高峰；对5龄第6天飞蝗不同组织部位LmCht10的表达研究发现,LmCht10在前肠表达最多,其次为表皮、后肠。三、LmCht10的生物学功能研究。进一步对LmCht10进行RNA干扰实验,研究其生物学功能。结果表明：2龄至5龄任一龄期飞蝗若虫注射AsLmCht10后,几丁质酶基因LmCht10被沉默,表达量显著降低；飞蝗发育过程中,表现为蜕皮延迟,新旧表皮无法分离导致死亡；成虫注射dsLmCht10后,雌虫的寿命明显缩短,产卵量下降,部分虫卵发育畸形甚至无法发育。四、RNAi介导的转基因抗虫玉米研究。基于LmCht10在飞蝗发育过程中的重要作用,构建表达dsLmCht10的重组pBI121质粒,通过花粉介导转入玉米植株,进一步开展RNAi介导的转基因抗虫作物研究。结论：飞蝗具有多个几丁质酶基因,它们的时空表达特性存在差异；LmCht10是一个具有5个几丁质酶催化区与6个几丁质结合区、分子量巨大的几丁质酶,其在飞蝗发育过程中具有十分重要的生物学功能,该基因被沉默后飞蝗无法完成蜕皮而导致死亡,将其用于RNAi介导的害虫防治具有潜在的应用价值。

飞蝗几丁质酶基因的功能研究

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