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毕赤酵母工程菌产植酸酶的发酵优化及其耐热稳定性研究

作　者: 龙跃
导　师: 吴晓英；杨博
学　校: 华南理工大学
专　业: 生物制药
关键词: 植酸酶毕赤酵母发酵优化热稳定性实际应用
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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引　用: 2次
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内容摘要

植酸酶（E.C.3.1.3.8 phytase）是催化植酸（肌醇六磷酸）及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。磷是动物体内一种必需的矿物质,在参与体内正常的新陈代谢中起着重要的作用。大量研究表明,在猪、禽日粮中添加植酸酶,可使饲料中磷的利用率提高60%,粪便中磷的排出量减少40%,从而可以减少饲料中磷的添加量,这对提高畜牧生产效益及降低环境污染有重要意义。目前植酸酶已经商品化,把植酸酶作为饲料添加剂已应用于实际生产,但仍然存在阻碍其广泛应用的技术难题,其中最主要的是植酸酶的耐热性问题。本研究是以本实验室保存的产植酸酶的毕赤酵母工程菌为生产菌种,首先在摇瓶水平上采用部分因素筛选法,对7个因素:诱导时间、诱导pH、诱导甲醇量、生长时间、接种量、生长pH、诱导温度进行筛选,运用MiniTab软件对实验结果分析筛选出显著因素分别为诱导pH,诱导甲醇量,生长时间和接种量,再对其单因素进行优化,得到毕赤酵母工程菌产植酸酶在摇瓶水平中的最适条件分别为诱导时间72h、诱导pH为4,诱导甲醇添加量1.5%、菌种生长期时间20h、接种量10%、生长pH为5、诱导温度28℃,为高密度发酵罐发酵提供数据参考基础。然后以摇瓶发酵得到的优化工艺条件为基础,在30L发酵罐中对诱导时间、诱导pH、诱导甲醇补加策略和诱导温度进行单因素梯度优化,找出毕赤酵母工程菌产植酸酶高密度发酵最适条件以提高植酸酶的表达量,其条件为:生长时间20h,甲醇流加速度5mL/（L·h）,诱导期甘油流加速度1mL/（L·h）,诱导pH为4,诱导时间84h,诱导温度24℃,优化条件下的毕赤酵母工程菌发酵产植酸酶的酶活力明显高于未优化前,酶活力可达到486U/mL,比未优化前提高289%。接着对目的产物植酸酶进行酶学性质的研究,在pH3-8的缓冲溶液的体系中测定植酸酶的最适合pH,本实验室植酸酶在pH3-6的酶活残余量保持60%以上的活性;分析了4种无机盐和4种糖类提高其耐热性的能力,实验结果添加0.8mmol/mLNH₄⁺和0.4mmol/mL蔗糖可以提高植酸的热稳定性,在50-90℃分别处理10min后相对酶活仍可达到80%以上,并且在存放2个月后仍可以维持50%以上的酶活力。最后将植酸酶投入实际生产应用,用于草鱼养殖中,以不同的商业化的植酸酶和磷酸二氢钙比较,实验得到结果当添加比率为0.08%时基本可以完全替代磷酸二氢钙。本研究得到毕赤酵母工程菌产植酸的高密度发酵条件,提高了植酸酶的表达量,提高了植酸酶的热稳定性和在饲料中替代磷酸二氢钙的添加量,确定本实验室的植酸酶具有一定的商业价值和应用前景,并为大规模生产提供科学依据。

毕赤酵母工程菌产植酸酶的发酵优化及其耐热稳定性研究

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