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凝血因子Ⅷ在毕赤酵母中的表达

作　者: 王泽
导　师: 徐存拴
学　校: 河南师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 人凝血因子Ⅷ 毕赤酵母 整合 发酵
分类号: R554.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 57次
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内容摘要


人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ,hFⅧ)在人凝血机制内部途径的级联反应中起着必不可少的作用,该因子的先天性缺陷会导致甲型血友病。目前,临床上治疗这种疾病多采用蛋白替代疗法,即输入含hFⅧ的制剂。世界上血友病患者众多,发病率在1/10000-3/10000。如此大的需求量单靠从血浆中提取无法满足市场的需求。因此,利用基因工程方法生产hFⅧ无疑具有巨大的商业价值。鉴于毕赤酵母自身强力的表达系统,本文利用毕赤酵母GS115为受体菌,筛选出能分泌重组人凝血因子Ⅷ(recombinant human coagulation factorⅧ,rhFⅧ)的基因工程菌株,并对该蛋白的发酵条件进行初步研究。本文在构建rhFⅧ基因工程菌时采用了适合该菌株的分泌型表达载体pPIC9,成功构建了重组表达质粒pPIC9-FⅧ。该质粒经SalI线性化,电转化整合入毕赤酵母GS115的染色体中。经基因组PCR筛选出阳性克隆,MM和MD平板筛选出His~+ Mut~+表型,BMGY/BMMY培养基摇瓶振荡培养,SDS-PAGE鉴定培养物上清等步骤,最终得到能表达rhFⅧ的阳性菌株。对其表达模式的研究发现,随着诱导时间的延长,该蛋白的表达量增加,并在144h达到高峰。本论文通过BMGY/BMMY培养基摇瓶振荡培养对发酵条件进行了摸索。结果显示,在28℃,250rpm,每24h添加1%甲醇的诱导条件下rhFⅧ有微弱表达。以上结果表明,本研究利用毕赤酵母成功表达了hFⅧ蛋白,虽然表达量极低,但这为进一步研究hFⅧ在毕赤酵母中的高效表达打下了基础。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
缩略语表  9-11
1 前言  11-33
  1.1 人凝血因子Ⅷ研究进展  11-19
    1.1.1 人凝血因子Ⅷ简介  11-14
    1.1.2 体内凝血机制  14-15
    1.1.3 血友病A 与凝血因子Ⅷ  15-16
    1.1.4 血浆中人凝血因子Ⅷ的分离纯化  16-17
    1.1.5 重组人凝血因子Ⅷ国内外研究近况与应用前景  17-19
    1.1.6 存在的问题  19
  1.2 毕赤酵母表达系统研究进展  19-32
    1.2.1 毕赤酵母表达系统简介  19-22
    1.2.2 表达载体简介  22-24
    1.2.3 载体与基因组的整合  24-27
    1.2.4 外源蛋白的表达  27-29
    1.2.5 影响外源基因表达的因素及提高蛋白表达的途径  29-32
    1.2.6 展望  32
  1.3 论文新颖性  32-33
2 材料与方法  33-51
  2.1 材料  33-36
    2.1.1 主要实验材料  33
    2.1.2 主要试剂  33-34
    2.1.3 贮存液和培养基  34-36
    2.1.4 主要仪器设备  36
  2.2 实验方法  36-51
    2.2.1 人肝总RNA 的提取和反转录  36-37
    2.2.2 PCR 扩增目的基因  37-39
    2.2.3 FⅧ单段基因克隆载体的构建及鉴定  39-41
    2.2.4 FⅧ双段基因克隆载体的构建及鉴定  41-43
    2.2.5 FⅧ完整基因克隆载体的构建及鉴定  43-44
    2.2.6 重组表达质粒pPIC9-FⅧ的构建及鉴定  44-45
    2.2.7 毕赤酵母的转化  45-46
    2.2.8 基因组PCR 法鉴定阳性重组子  46-48
    2.2.9 MM 和MD 平板筛选His~+ Mut~+阳性克隆  48
    2.2.10 重组酵母菌的诱导表达  48
    2.2.11 SDS-PAGE 电泳  48-51
3 结果  51-61
  3.1 人肝总RNA 的提取和反转录  51
  3.2 人凝血因子Ⅷ基因的克隆及测序  51-57
    3.2.1 单段凝血因子Ⅷ基因的克隆及测序  51-55
    3.2.2 双段凝血因子Ⅷ基因的克隆及测序  55-56
    3.2.3 完整凝血因子Ⅷ基因的克隆及测序  56-57
  3.3 重组表达载体pPIC9-FⅧ的构建及鉴定  57-58
  3.4 重组质粒转入毕赤酵母后的验证  58
  3.5 MM 和MD 平板筛选His~+ Mut~+表型  58-59
  3.6 重组人凝血因子Ⅷ的诱导表达及SDS-PAGE 检测  59-61
    3.6.1 诱导时间对毕赤酵母表达重组人凝血因子Ⅷ的影响  59
    3.6.2 诱导温度对毕赤酵母表达重组人凝血因子Ⅷ的影响  59-60
    3.6.3 甲醇浓度及添加频率对毕赤酵母表达重组人凝血因子Ⅷ的影响  60-61
4 讨论  61-65
参考文献  65-73
总结与结论  73-75
攻读硕士学位期间参加的科研项目和发表论文  75-77
致谢  77-78

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 血液及淋巴系疾病 > 血液疾病 > 出血性疾病 > 血友病
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