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建立基于人PPARs为靶标的药物筛选细胞平台

作　者: 马晶晶
导　师: 章涛
学　校: 遵义医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 过氧化物酶体增殖物激活受体报告基因药物筛选转染 293T细胞
分类号: R965.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)可介导多种物质代谢途径和药物治疗效应。本研究旨在通过PPARs基因载体质粒与过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)报告质粒共转染 293T细胞,人工模拟PPARs信号通路,通过阳性药物干预实验,评价该细胞模型作为药物筛选新平台应用的可行性,为进一步筛选具有生物活性的PPARs配体激动剂提供一种新的细胞模型筛选方法。方法：(1)细胞培养及质粒共转染：用含10%胎牛血清的HG-DMEM于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养293T细胞。取第3代细胞,按8×104个细胞/孔的细胞密度接种于24孔板中,待细胞生长汇合度达90～95%时,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000进行质粒共转染。实验分为phPPARa-IRES2-EGFP转染组、phPPARy-IRES2-EGFP转染组和空载体pIRES2-EGFP转染组(对照组),每组均共转染含人PPRE报告质粒ptk-PPRE×3-luc(含萤火虫荧光素酶报告基因)、内部对照质粒pRL-CMV(含海肾荧光素酶报告基因)。(2)转染效率检测：转染36 h后,采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,并用流式细胞术(FCM)检钡phPPARa-IRES2-EGFP和phPPARy-IRES2-EGFP质粒的转染效率。(3)特异性PPARs配体阳性药物干预293T细胞转染体系：转染14 h后,各转染组分别力入1‰DMSO、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6 mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L浓度梯度的阳性药物(phPPARa-IRES2-EGFP转染组选用WY14643, phPPARy-IRES2-EGFP转染组选用罗格列酮),药物作用24 h后采用双荧光素酶报告基因检测法(DLR)检测双荧光素酶活性,获得不同药物浓度作用下的双荧光素酶报告基因比值(F/R值),分析阳性药物作用的量-效关系；并用10-5 mol/L浓度阳性药物干预实验进行时-效分析。(4)PPARs药物筛选细胞平台特异性鉴定：对上述反应体系交叉更换干预药物,PPARa反应体系采用罗格列酮,而PPARy则用WY14643,用以检测上述体系的特异性。实验还采用RXRa配体全反式维甲酸(ATRA)代替PPARs日性药物,分别对上述反应体系进行干预,以了解上述体系是否可通过全反式维甲酸激动。(5)荧光定量PCR检测阳性药物作用后各转染组细胞PPARs及RXRa基因mRNA表达水平。(6)PPARs药物筛选细胞平台应用能力评价：采用临床使用的贝特类降脂药苯扎贝特、环丙贝特、氯贝丁酯对建立的PPARa药物筛选细胞平台进行应用检测。结果：(1)荧光显微镜下phPPARa-IRES2-EGFP和phPPARy-IRES2-EGFP转染293T细胞呈现绿色荧光；FCM分析结果显示,2种质粒转染组转染效率分别达为68.30%和67.56%,荧光显微镜观察GFP报告基因表达强。(2)阳性药物干预相应293T细胞转染体系的F/R值均具有良好的量-效和时-效关系,DLR检测量-效分析结果：2种人PPARs基因细胞转染体系的PPRE报告质粒荧光素酶报告基因表达水平(F/R值)随着相应阳性药物浓度升高而升高,但药物浓度过高又会抑制其表达F/R值反而降低(P<0.01),而空载体pIRES2-EGFP转染组在不同药物及浓度作用下的F/R值始终呈低值基线状态；时-效分析结果：2种人PPARs基因细胞转染体系的PPRE报告质粒荧光素酶报告基因表达水平(F/R值)随着相应阳性药物作用时间的延长而升高(P<0.01). (3)PPARa特异性配体WY14643不能激动PPARy转染的293T细胞反应体系,而罗格列酮则可部分激动PPARa转染的293T细胞反应体系,但其反应强度不及WY14643(P<0.05)。2种PPAR转染细胞体系均不能被全反式维甲酸有效激活。(4)RT-PCR检测结果显示,不同阳性药物及浓度作用下的phPPARa-IRES2-EGFP转染组293T细胞PPARa mRNA表达水平比空载体对照组高4个数量级,phPPARy-IRES2-EGFP转染组293T细胞PPARy mRNA表达水平比空载体对照组高2～3个数量级,mRNA表达水平提示导入的重组质粒能够高效表达PPARs。而各组RXRamRNA呈一致性的低水平表达。(5)贝特类降脂药苯扎贝特、环丙贝特、氯贝丁酯对建立的PPARa药物筛选细胞平台均呈现良好的量-效反应性,但反应强度因3种药物浓度不同而存在差异(P<0.05)。结论：成功构建了一种新的基于以人PPARs受体为靶标的药物筛选细胞平台,为进一步研究PPARs功能和筛选PPARs配体激动药物提供了一种模拟信号通路的生物活性反应模型体系。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-11
前言  11-13
1 材料  13-16
  1.1 质粒和细胞株  13
  1.2 主要试剂  13-14
  1.3 主要实验仪器及耗材  14-15
  1.4 主要试剂的配制  15-16
2 方法  16-23
  2.1 质粒扩增与抽提  16-17
  2.2 293T细胞的培养  17-18
  2.3 质粒共转染293T细胞  18
  2.4 药物干预  18-19
  2.5 双荧光素酶报告基因检测法检测双荧光素酶活性  19-20
  2.6 荧光定量PCR检测不同浓度阳性药物干预的转染细胞hPPARα、hPPARγ及RXRα mRNA表达  20-23
  2.7 PPARα药物筛选细胞模型的应用  23
  2.8 统计学处理  23
3 结果  23-38
  3.1 转染PPARs基因质粒293T胞GFP表达情况及转染效率分析  23-25
  3.2 转染PPARs基因质粒293T细胞药物干预后的荧光素酶报告基因表达检测  25-29
  3.3 药物干预状态下转染的293T细胞hPPARs、RXRα mRNA的表达  29-36
  3.4 PPARα药物筛选细胞平台的应用测试结果  36-38
4 讨论  38-43
5 结论  43-44
参考文献  44-49
综述  49-57
  参考文献  53-57
致谢  57-58
作者简介  58

建立基于人PPARs为靶标的药物筛选细胞平台

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