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猪链球菌2型IMPDH单克隆抗体的制备及其识别表位分析

作　者: 周俊明
导　师: 何孔旺；陆承平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(IMPDH) 单克隆抗体表位免疫印迹
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,SS₂）是我国猪链球菌病的重要病原,不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡,还可感染相关人员并致死,是一种重要的人畜共患病病原。SS2可区分为强毒株、弱毒株和无毒株,在已发现的毒力基因orf2和mrp之间存在一个新的开放阅读框,本课题组通过酶活性染色已证实该阅读框编码的蛋白具有次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）活性,本研究为了深入认识猪链球菌2型中IMPDH的免疫学特性,利用原核表达的IMPDH融合蛋白制备出了特异性针对猪链球菌2型IMPDH单克隆抗体并对其识别的表位区域进行了分析。1 SS2中IMPDH单克隆抗体的制备及鉴定利用转化有pET-IMPDH连接质粒的大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量为48kDa的融合蛋白。亲和层析柱纯化融合蛋白后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经4次有限稀释法克隆,成功获得1A8、1F2、2D2、2D12共4株能稳定传代并分泌抗IMPDH的单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株。4株腹水型单克隆抗体的间接ELISA效价分别为100×2¹¹、100×2¹¹、100×2¹⁰、100×2⁸。经Western-blot分析表明,4株单抗与IMPDH均具有特异性反应,而与空载体表达的硫氧还蛋白没有反应,表明了单克隆抗体具有良好的特异性。2猪链球菌2型IMPDH单克隆抗体识别表位差异性分析利用4种IMPDH全基因分片段缺失表达的融合蛋白,通过Western-blot分析了1A8、1F2、2D2、2D12四株单克隆抗体的表位差异性,结果显示前3株单抗与P-D1、P-D2、P-D3三种基因缺失表达蛋白均有反应,但与P-D4基因缺失表达蛋白均没有反应,2D12与P-D1、P-D2均有反应,而与P-D3、P-D4没有反应,初步推断1A8、1F2、2D2三株单抗针对表位的编码基因集中在IMPDH基因片段的627～790bp之间,2D12的表位编码基因集中在IMPDH基因片段的411～790bp之间。继而将这两段基因分别进行原核表达,获得目的蛋白,经过Western-blot分析,结果显示1A8、1F2、2D2、2D12四株单抗均与412～791bp基因片段表达产物有特异性反应,1A8、1F2、2D2三株单抗与613～809bp基因片段表达产物有特异性反应,而2D12却与613～809bp基因片段表达产物没有反应,与前期实验推断相符,并推断4株单抗识别的表位属于线性表位。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一篇文献综述  10-30
  猪链球菌2型的研究进展  10-30
    1 病原学  10-11
    2 流行病学  11
    3 临床症状与病理变化  11-13
    4 致病机理  13-17
    5 毒力因子  17-23
    6 参考文献  23-30
第二篇研究报告  30-57
  第一章猪链球菌2型IMPDH单克隆抗体的制备及鉴定  30-40
    1 材料和方法  31-34
    2 结果  34-36
    3 讨论  36-38
    4 参考文献  38-40
  第二章猪链球菌2型IMPDH单克隆抗体识别表位分析  40-46
    1 材料和方法  40-42
    2 结果  42-43
    3 讨论  43-45
    4 参考文献  45-46
  第三章 IMPDH单克隆抗体识别区域的克隆与原核表达  46-57
    1 材料和方法  47-52
    2 结果  52-54
    3 讨论  54-56
    4 参考文献  56-57
附录:常用试剂的配制  57-60
全文总结  60-62
致谢  62

猪链球菌2型IMPDH单克隆抗体的制备及其识别表位分析

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