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棉铃虫幼虫中肠脂筏理化性质研究及钙粘素免疫检测

作　者: 韦宏伟
导　师: 苏建亚
学　校: 南京农业大学
专　业: 农药学
关键词: 棉铃虫 BBMV 脂筏酶活性酶联免疫点印迹免疫印迹
分类号: S435.622.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

脂筏是细胞膜上富含胆固醇、鞘脂类和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚着蛋白的去垢剂不溶性微结构域。根据脂筏在低温(4℃)不溶于去垢剂的性质,我们用去垢剂TritonX-100处理棉铃虫幼虫及其它三种鳞翅目幼虫(菜青虫,斜纹夜蛾,二化螟)中肠刷状缘膜囊泡,溶解非脂质筏,再用Optiprep密度梯度离心将去垢剂不溶组分分离。以神经节苷脂(GM1)作为脂筏的标志分子,采用辣根过氧化物酶标记的霍乱毒素-p-亚基对其进行亲和标记,点印迹法化学发光检测神经节苷脂的表达。结果成功分离制备了四种鳞翅目昆虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡上脂筏。比较了转Bt基因棉棉铃虫抗性品系(YCR)和敏感品系(YCS)幼虫中肠液、BBMV及其上脂筏中的酶活性。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶是两类主要的丝氨酸蛋白酶,测定结果显示两种酶活性是中肠液高于BBMV, BBMV高于其上脂筏；氨肽酶活性则相反：中肠液活性远远低于BBMV,而BBMV低于其上脂筏的活性,这是由于氨肽酶是GPI-锚膜蛋白,在中肠液中的含量较低,而BBMV中氨肽酶活性低于其上脂筏活性说明相对BBMV,氨肽酶在脂筏中有一定程度的富集。而比较抗感品系之间大部分酶活性均是敏感品系高于抗性品系。仅碱性磷酸酯酶中肠液,总蛋白酶中脂筏抗性高于敏感品系。比较了四种鳞翅目昆虫—棉铃虫、斜纹夜蛾、二化螟和菜青虫幼虫BBMV和其上脂筏的酶活性。其中氨肽酶的活性均存在BBMV低于其上脂筏的关系,而胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,碱性磷酸酯酶均存在BBMV高于其上脂筏的关系。其后又对实验数据进行进行如下处理：将每种昆虫BBMV和脂筏酶活性相比得到一数值发现它们的差异程度存在如下关系：二化螟大于菜青虫,菜青虫大于斜纹夜蛾(以棉铃虫敏感品系为标准),这与几种昆虫在分类上的近远源关系是一致的。研究中我们分别采用点印迹(Dot-blot),酶联免疫(ELISA)和免疫印迹(Western blotting)的方法检测棉铃虫抗性和敏感品系中的钙粘蛋白。应用Dot-blot和ELISA方法检测时,分别从定性和定量的角度对钙粘蛋白在昆虫中肠的存在情况进行分析,在Dot-blot检测中,敏感品系的斑点相对于抗性品系具有较深的印迹,可与室内的敏感品系明显区分；在ELISA检测中,敏感品系的OD值高于抗性品系的OD值,且差异显著,两种检测方法结果一致。ELISA检测具有分析容量大,标准化程度高的特点；Dot-blot具有操作简便,灵敏度高的特点,该研究为田间棉铃虫的钙粘蛋白缺失突变造成的抗性检测提供了技术支持,为Bt抗性的检测提供了又一可能的技术手段。

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摘要 6-8ABSTRACT 8-10名词缩写 10-11第一章文献综述 11-31 1.1 脂筏 11-22 1.1.1 脂筏概述 11-12 1.1.2 脂筏的结构 12-13 1.1.3 脂筏的生物学特性 13 1.1.4 脂筏的分离与制备 13-14 1.1.5 脂筏的功能 14-22 1.2 Bt研究进展 22-28 1.2.1 Bt作用机理 22-23 1.2.2 害虫对Bt毒素抗性机理 23-28 1.2.3 Bt的生产应用情况 28 1.2.4 Bt与脂筏的关系研究 28 1.3 棉铃虫研究 28-30 1.3.1 棉铃虫的发生与危害 28-29 1.3.2 棉铃虫的化学防治 29 1.3.3 Bt棉的应用情况 29-30 1.3.4 棉铃虫的抗药性情况 30 1.4 本论文研究目的意义 30-31第二章材料与方法 31-41 2.1 试验材料 31-33 2.1.1 供试昆虫 31 2.1.2 主要试剂 31 2.1.3 主要溶液的配制 31-33 2.1.4 主要仪器 33 2.2 中肠液的制备 33 2.3 BBMV与脂筏的制备 33-35 2.3.1 BBMV的制备 33-34 2.3.2 脂筏的制备 34 2.3.3 脂筏的鉴定 34-35 2.4 胆固醇含量测定 35 2.5 蛋白质含量的测定 35 2.6 酶活性测定 35-36 2.6.1 总蛋白酶活力测定 35 2.6.2 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活性测定 35 2.6.3 氨肽酶活性的测定 35-36 2.6.4 碱性磷酸酯酶活性的测定 36 2.6.5 中肠酯酶活性测定 36 2.7 PAGE电泳 36 2.7.1 中肠BBMV和脂筏蛋白SDS-PAGE电泳 36 2.7.2 酯酶同功酶电泳 36 2.8 钙粘蛋白的抗体检测 36-39 2.8.1 幼虫中肠粗提液的制备 36-37 2.8.2 Dot-blot检测 37 2.8.3 ELISA检测 37-38 2.8.4 Western-blotting检测 38-39 2.9 统计与分析 39-41第三章结果与分析 41-55 3.1 脂筏的制备与鉴定 41-42 3.2 中肠脂筏总胆固醇含量 42-43 3.3 棉铃虫中肠液、BBMV和脂筏酶活性分析 43-47 3.4 四种鳞翅目幼虫间酶活性的比较 47-49 3.5 SDS-PAGE电泳分析 49-51 3.5.1 BBMV和脂筏蛋白PAGE电泳 49-50 3.5.2 酯酶同功酶SDS-PAGE电泳 50-51 3.6 钙粘蛋白的免疫检测 51-55 3.6.1 Dot-blot法检测 51 3.6.2 Western blotting法检测 51 3.6.3 ELISA法检测钙粘蛋白 51-55第四章讨论 55-65 4.1 脂筏的制备与鉴定方法 55-56 4.2 脂筏的理化性质与酶活性 56-60 4.3 Bt抗性与脂筏的关系 60-62 4.4 钙粘蛋白的免疫检测与Bt抗性检测技术 62-65参考文献 65-81全文总结 81-83致谢 83

棉铃虫幼虫中肠脂筏理化性质研究及钙粘素免疫检测

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