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羟基喜树碱调控青光眼术区纤维化的实验研究

作　者: 范莲
导　师: 袁志兰
学　校: 南京医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 羟基喜树碱 丝裂霉素 人眼Tenon’s囊成纤维细胞 抑制作用 青光眼滤过性手术 瘢痕化
分类号: R779.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:通过体外培养人眼Tenon’s囊成纤维细胞(Human Tenon’s capsule fibroblasts,HTFs),观察羟基喜树碱(HCPT)对HTFs增殖、移行及细胞周期的影响,探讨其可能的作用机制,并与丝裂霉素C(MMC)对比。方法:1、HTFs的体外培养和鉴定:取正常供体新鲜的Tenon’s囊组织,采用组织块培养法,进行成纤维细胞的体外培养,并用光镜、免疫荧光法观察鉴定; 2、MTT法检测不同浓度的羟基喜树碱(0.031、0.062、0.125、0.25、0.5、1、2、4mg/l)、丝裂霉素(0.0031、0.0062、0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4mg/l)作用24h、48h、72h后HTFs的A值变化,观察两种药物对HTFs的抑制作用,并进行对比; 3、流式细胞仪测定羟基喜树碱及丝裂霉素C对HTFs细胞周期的影响; 4、采用划痕法检测羟基喜树碱及丝裂霉素C对HTFs迁移的抑制能力; 5、通过台盼蓝染色法鉴定羟基喜树碱、丝裂霉素C对HTFs增殖、迁移的抑制作用是否由药物的细胞毒性引起; 6、琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡结果; 7、Realtime PCR检测羟基喜树碱、丝裂霉素C作用24后HTFs的Smad7 mRNA基因表达的变化,探讨羟基喜树碱抑制HTFs增殖的可能机制。结果:1、体外成功培养正常HTFs,细胞长梭形,胞浆丰富,胞核大,生长能力强,呈漩涡状或羽毛状生长;HTFs波形蛋白染色阳性、角蛋白染色阴性,证实所培养的细胞为成纤维细胞,而非上皮细胞;2、MTT法显示不同浓度的HCPT组、MMC组作用24h、48h、72h后HTFs细胞的增值率均低于空白对照组,差异具有统计学意义;HCPT(0.031—0.125mg/l)、MMC(0.0031—0.0125mg/l)对HTFs的抑制率不显著增高,HCPT(0.25—4mg/l)、MMC(0.025—0.4mg/l)对HTFs的抑制率显著增高,呈现剂量依赖性和时间依赖性;HCPT作用24h、48h、72h的IC50分别为2.24mg/l、0.76mg/l、0.39mg/l,MMC作用24h、48h、72h的IC50分别为0.34mg/l、0.24mg/l、0.07mg/l,MMC对HTF增殖的抑制效应约要强于HCPT;3、流式细胞仪检测HCPT(0、0.25、1、4mg/l)、MMC(0、0.025、0.1、0.4mg/l)对HTFs细胞周期的影响,结果显示HCPT主要影响HTFs的G2期和S期,MMC主要将HTFs阻滞于G1期;4、划痕法检测不同浓度的HCPT、MMC作用24h、48h、72h后对HTFs迁移能力的影响,结果显示HCPT、MMC作用后HTFs的迁移能力受到抑制,这种抑制作用呈剂量依赖性而与时间无显著相关;5、台盼蓝染色法检测HCPT(0、0.25、0.5、1、2、4mg/l)、MMC(0、0.0025、0.05、0.1、0.2、0.4)作用24h后HTFs的活细胞率,结果显示HCPT组、MMC组活细胞率和空白对照组比较均无统计学差异;6、0.4mg/lMMC、4mg/lHCPT作用HTFs24h后,提取出的DNA经过1%琼脂糖凝胶电泳,呈现细胞凋亡后特异性梯状条带;7、Realtime PCR检测0.4mg/lMMC、4mg/lHCPT作用HTFs24h后,Smad7 mRNA表达水平显著上调。结论:1、羟基喜树碱和丝裂霉素C对体外培养HTFs的增殖、迁移有明显抑制作用,这种抑制作用呈剂量和时间依赖性。该两种药物对HTFs增殖、迁移的抑制效应:MMC约为HCPT的10倍左右,HCPT的安全性要高于MMC;2、羟基喜树碱主要影响HTFs的G2和S期,丝裂霉素C主要将HTFs阻滞于G1期(静止期);3、羟基喜树碱、丝裂霉素C抑制HTFs增殖、迁移的作用和药物的细胞毒性无关;4、羟基喜树碱及丝裂霉素C均能诱导HTFs凋亡;5、羟基喜树碱抑制HTFs增殖的机制可能是:通过上调Smad7 mRNA的表达阻断TGF—β信号通路从而抑制HTFs增殖和迁移。

全文目录


中文摘要  5-8
Abstract  8-11
前言  11-16
材料与方法  16-29
结果  29-46
讨论  46-51
结论  51-52
参考文献  52-58
综述  58-66
  参考文献  63-66
缩略词  66-67
攻读学位期间发表文章情况  67-68
致谢  68-69

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 眼外科手术学
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