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丝裂霉素C对鼻咽癌细胞HNE2和HNE2/LMP-1抑制作用及其机制

作　者: 明昊
导　师: 陈仁杰
学　校: 南京医科大学
专　业: 耳鼻喉头颈外科
关键词: 丝裂霉素C 鼻咽癌细胞凋亡 Caspase-3 膜潜伏蛋白-1
分类号: R739.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是鼻咽上皮来源的恶性肿瘤,在我国具有很高的发病率,对放化疗敏感。放射治疗是首选治疗方法。肿瘤位于颅骨底部,治疗区域周围的组织如脑干、脊髓、眼、中耳、内耳、甲状腺、垂体-下丘脑轴等对放射线敏感,因此治疗后会出现远期并发症。由于鼻咽癌有浸润和远处转移的倾向,对这些组织的保护变得更加困难。化学疗以顺铂、5-氟尿嘧啶为主。有报道改善同步治疗和辅助治疗的使用可提高其治疗耐受性、降低副反应、提高对高度恶性病例的疗效。虽然化疗可提供更好的对局部肿瘤的控制,顺序使用放疗和化疗对远处转移更加有效,但同步放化疗远处转移治疗的失败是其一大难题,其用于IV期患者治疗的前景堪忧。鼻咽癌复发、转移,对再次放疗和同类化疗药物抵抗致使其疗效不佳。肿瘤复发和转移是死亡的主要原因。乏氧肿瘤细胞对顺铂和5-氟尿嘧啶放疗不敏感,这是肿瘤复发的主要原因。因此选择有效的抗药性低的化疗药物具有极其重要的临床意义。丝裂霉素C(mitomycin C, MMC)是从头状链霉菌培养液中分离提取的一种广谱抗肿瘤抗生素,对多种实体肿瘤有效,已经用于临床多种肿瘤的治疗,但在鼻咽癌的抑瘤效应鲜有报道。其作用机理是通过烷化基团和DNA双螺旋形成交联,破坏DNA和RNA的结构,引起细胞凋亡。有研究表明丝裂霉素C在缺氧环境仍有较高活性,对G0期细胞比较敏感,有助于克服化疗药物的抗药性。另外丝裂霉素结构特殊,含有包括醌环、吲哚、氮丙啶环以及甲氧甲酰胺侧链,适合与抗体等偶联,在肿瘤的靶向治疗中有应用前景。因此选择MMC作为治疗复发性鼻咽癌的候选化疗药,具有重要的临床意义。Caspases家族、Bcl-2家族、p53等多种因子都参与了MMC诱导的细胞凋亡,对其凋亡通路的进一步研究可为临床肿瘤治疗提供一定的实验依据。其中Caspase-3广泛分布于各种不同类型的细胞中,是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一,激活的Caspase-3能使许多与细胞结构、细胞周期及DNA修复等相关蛋白或激酶失活,从而诱发细胞凋亡。在应用MMC诱导膀胱癌EJ细胞凋亡的研究中发现,Caspase-3的激活是MMC诱导EJ细胞凋亡的必须步骤,应用Caspase-3抗体阻断Caspase-3激活可以特异性抑制MMC诱导的EJ细胞凋亡。鼻咽癌的发生发展与遗传因素、环境因素、EB病毒(Epstain-Barr virus,EBV)潜伏感染密切相关。其中EBV-潜伏膜蛋白1(latent membrance protein 1, LMP-1)的功能涉及多种信号转导途径,通过不同的信号级联放大作用,诱导大量的细胞内基因表达,从而提高细胞的存活能力、黏附能力、侵袭能力和血管生成能力,参与鼻咽癌的发生、发展和转移。目的:本试验选用人鼻咽癌HNE2细胞系和转染野生型LMP-1基因稳定表达的鼻咽癌细胞系HNE2/LMP-1,通过MMC对鼻咽癌细胞HNE2和HNE2/LMP-1的抑制率和凋亡相关检测,分析MMC促凋亡的可能机制,为临床鼻咽癌MMC化疗提供实验依据,也从一个侧面分析LMP-1在促进鼻咽癌细胞生长和抗凋亡中的作用。方法:1.鼻咽癌细胞HNE-2和HNE-2/LMP-1培养及收集。2.给予不同浓度MMC 40、20、10、5、2.5μg/ml作用于HNE2和HNE2/LMP-1细胞系12和24h后,MTS法检测MMC对人鼻咽癌细胞系HNE2和HNE2/LMP-1的生长抑制作用。绘制生长曲线,估算MMC对HNE2和HNE2/LMP-1细胞系的50%抑制浓度(50% inhibiting concentration ,IC50)。3.研究MMC对鼻咽癌细胞系HNE2形态学影响。20μg/mlMMC作用鼻咽癌细胞系HNE224h后,荧光显微镜观察凋亡早期细胞细胞(呈绿色,细胞形状不规则,如呈新月形)晚期凋亡细胞(细胞核呈橙色,细胞核碎裂成点状)。设0μg/mlMMC为空白对照,记数1000个细胞。细胞凋亡比例=(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/1000×100%。4.碘化丙啶染色流式细胞术检测10μg/ml MMC作用24h对鼻咽癌细胞系HNE2和HNE2/LMP-1凋亡和周期的变化的影响。5.比色法检测20、10μg/ml MMC作用12和24h后鼻咽癌细胞系HNE2和HNE2/LMP-1凋亡Caspase-3通路的活性变化。Caspase-3活化度=(丝裂霉素组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)6.统计学分析。实验数据均以均数±标准差(x±s),采用SPSS12.0统计软件进行对数据进行T检验、方差齐性检验,三因素方差分析。方差分析两两比较应用LSD和S-N-K法。P值<0.05认为差异有统计学意义。结果:1. MMC对鼻咽癌HNE2和HNE2/LMP-1细胞生长有明显的抑制作用,MMC作用浓度越高,作用时间越长对鼻咽癌细胞系HNE2和HNE2/LMP-1的抑制作用越明显。40μg/mlMMC作用24h后的最大制率分别为(79.01±5.32)%和(76.45±4.36)%,24h时MMC对鼻咽癌细胞系HNE2和HNE2/LMP-1的半数抑制浓度IC50为19μg/ml和28μg/ml。2. 20μg/mlMMC作用于HNE2细胞24h后可见细胞凋亡的典型变化,悬浮细胞增多,细胞胞体缩小、变圆、碎裂,胞内出现颗粒样物质,其凋亡计数为354个,细胞凋亡比率为35.4%。3.流式细胞术结果表明, 10g/ml MMC作用24h后鼻咽癌细胞系HNE2和HNE2/LMP-1细胞凋亡的比率分别由4.46%和0.75%增高至18.09%和10.27%,而对细胞周期影响不明显。4. MMC能明显上调HNE2和HNE2/LMP-1细胞Caspase-3活性,且呈时间与浓度依赖性。20μg/mlMMC作用24h后鼻咽癌细胞系HNE2和HNE2/LMP-1的最大活化度分别为6.57±0.53%和5.12±1.15%。5.统计结果表明HNE2/LMP-1细胞比HNE2细胞具有较好的抵抗MMC诱导的凋亡作用。在MTS检测细胞生长抑制率的实验中,抑制率在HNE2和HNE2/LMP-1细胞株间存在差异(F=31.558 P<0.05)。在caspase-3活化度实验中,活化度在细胞株间存在差异(F=23.243 P<0.05)。结论:MMC可明显抑制鼻咽癌细胞HNE2和HNE2/lmp1的生长,促进细胞凋亡,其机制和Caspase-3有关。EBV-潜伏膜蛋白1(lmp1)可通过抑制caspase-3活性途径抑制HNE2细胞的凋亡对抗丝裂霉素的细胞生长抑制作用。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-10
前言  10-15
  参考文献  13-15
第一部分、MMC 对鼻咽癌细胞形态和生长抑制作用的实验研究  15-23
  材料与方法  15-18
  结果  18-22
  讨论  22-23
第二部分、MMC 对鼻咽癌细胞凋亡的影响及其机制研究  23-33
  材料与方法  23-25
  结果  25-31
  讨论  31-33
结论  33-34
文献综述  34-46
  参考文献  40-46
攻读学位期间发表文章情况  46-59
致谢  59

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