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成年母猪后肠道木聚糖酶产生菌的筛选及其产酶条件的研究

作　者: 吴兴群
导　师: 刘强；张铁鹰
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物营养与饲料
关键词: 木聚糖酶木聚糖筛选鉴定酶学性质
分类号: S816.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

半纤维素是仅次于纤维素含量第二丰富的可利用自然资源,其主要成分是木聚糖(xylan)。木聚糖酶是指可以将木聚糖催化水解成低聚木糖或木糖的酶系总称,包括多种内切酶和外切酶。内切β-1,4-D-木聚糖酶(endo-β-1,4-D-xylanase) [EC 3.2.1.8],简称木聚糖酶,是木聚糖降解酶系中最关键的酶,可以水解木聚糖为低聚木糖和D-木糖,它在饲料、食品、纸浆造纸、纺织等方面有着广阔的应用前景。本研究从产木聚糖酶菌株的筛选开始,筛选出一株木聚糖酶高产菌株,并对其产酶条件及酶学性质进行研究,主要研究结果如下：1.根据木聚糖酶分解木聚糖底物生成的寡糖,在菌落周围形成透明圈这一特性,以木聚糖为唯一碳源,根据不同菌株能否形成透明圈,决定需要复筛的菌株,经产酶培养基复筛后,筛选到一株木聚糖酶高产菌株,对其进行普通染色、革兰氏染色、形态学特征分析,初步确定该菌株为杆菌,并命名为Z1f。2.对菌株Z1f生长条件和产酶条件研究。为提高酶活力进行了一系列培养基及培养条件的优化实验,确定菌株Zlf产木聚糖酶的最适碳源是燕麦木聚糖,最适氮源是蛋白胨,最佳产酶时间是发酵60h,培养基最佳初始pH为6,培养温度为38℃。此时,细菌能很好的生长,并表现良好的产酶能力。改变木聚糖酶和底物作用时的温度和pH值,确定该酶的最适值及其耐受性。结果显示：该酶最适温度为50℃。该酶属于嗜中温酶类,无高温耐受性；该酶的适宜作用pH范围较广,在pH 5-8范围内保持较高的活性,最适作用pH值为6。各种金属离子对该酶都有不同的影响,1 mmol/L的Fe2+对酶活有激活作用,Fe3+对酶活有明显的抑制作用,其它离子的的作用不明显。当金属离子的浓度升高到5 mmol/L时,Cu2+对酶活有强烈的抑制作用,Fe3+、Mn2+次之,K+、Fe2+、Mg2+、Ag+、Ca2+对酶活性也有不同程度的抑制作用,但影响较小。

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摘要 7-8ABSTRACT 8-10文献综述 10-28 1. 木聚糖 10-13 1.1 木聚糖的化学组成 10-11 1.2 木聚糖的结构 11-12 1.3 木聚糖的生理功能 12 1.4 部分原料中木聚糖的含量 12-13 2. 木聚糖酶 13-28 2.1 木聚糖酶分类 13-14 2.2 木聚糖酶的性质 14-15 2.2.1 木聚糖酶的理化性质 14-15 2.2.2 木聚糖酶作用的环境条件 15 2.3 木聚糖酶的分离、纯化及其酶活性测定 15-16 2.4 木聚糖酶合成的影响因素 16-20 2.4.1 木聚糖酶的生产菌株 16-18 2.4.2 碳源及碳源的制备 18 2.4.3 氮源和碳氮比对木聚糖酶合成的影响 18-19 2.4.4 pH值对木聚糖酶合成的影响 19 2.4.5 温度对木聚糖酶合成的影响 19 2.4.6 金属离子 19-20 2.5 木聚糖酶的应用 20-24 2.5.1 木聚糖酶在畜禽营养中的应用 20-23 2.5.1.1 在反刍动物日粮中的应用 20-21 2.5.1.2 在单胃动物日粮中的应用 21-23 2.5.2 木聚糖酶在造纸工业中的应用 23 2.5.3 木聚糖酶在食品中的应用 23-24 2.5.4 木聚糖酶在其它方面的应用 24 2.6 木聚糖酶研究热点 24-26 2.7 课题的提出及意义 26-27 2.8 课题的主要研究内容与目标 27-28第一章产木聚糖酶菌株的筛选 28-38 1 材料与方法 29-34 1.1 材料 29-30 1.1.1 试验样品采集 29-30 1.1.2 半纤维素的制备 30 1.1.3 DNS试剂的配制 30 1.2 方法 30-34 1.2.1 接种与培养 30-32 1.2.1.1 厌氧稀释液配制与制备 30-31 1.2.1.2 富集培养基 31 1.2.1.3 筛选培养基 31 1.2.1.4 斜面培养基 31-32 1.2.1.5 种子培养基 32 1.2.1.6 基础产酶培养基 32 1.2.2 筛选方法 32-33 1.2.2.1 解冻与前处理 32 1.2.2.2 厌氧滚管培养法 32-33 1.2.2.3 菌株的发酵培养 33 1.2.2.4 木聚糖酶活力测定方法 33 1.2.3 主要仪器及设备 33 1.2.4 主要试剂 33-34 2 结果与分析 34-38 2.1 标准曲线的绘制 34 2.2 菌种的分离及初筛 34-35 2.3 菌株复筛结果 35-36 2.4 Z1f菌株初步鉴定 36 2.5 本章小结 36-38第二章菌株Z1f产酶条件优化及其酶学性质的研究 38-52 1 材料与方法 38-41 1.1 材料 38-39 1.2 方法 39-41 1.2.1 缓冲溶液的配制方法 39 1.2.1.1 磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液 39 1.2.1.2 巴比妥钠-盐酸缓冲液的配制 39 1.2.1.3 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 39 1.2.2 菌株产酶条件的优化培养 39-40 1.2.3 木聚糖酶的酶学特性研究 40-41 1.2.3.1 木聚糖酶的最适温度 40 1.2.3.2 木聚糖酶的热稳定性 40 1.2.3.3 木聚糖酶的最适反应pH 40 1.2.3.4 木聚糖酶的pH稳定性 40 1.2.3.5 金属离子对木聚糖酶活性的影响 40-41 2 结果 41-48 2.1 菌株Z1f产酶条件的优化 41-45 2.1.1 培养时间对菌体生长及产酶的影响 41-42 2.1.2 培养温度对菌体生长及产酶的影响 42-43 2.1.3 培养基起始pH值对菌体生长及产酶的影响 43-44 2.1.4 碳源对产酶的影响 44 2.1.5 氮源对产酶的影响 44-45 2.2 菌株Z1f产木聚糖酶的酶学性质研究 45-48 2.2.1 温度对木聚糖酶活性的影响 45-46 2.2.2 pH对木聚糖酶活性的影响 46 2.2.3 木聚糖酶的热稳定性分析 46-47 2.2.4 木聚糖酶的pH稳定性分析 47-48 2.2.5 金属离子对木聚糖酶活性的影响 48 3 讨论 48-50 3.1 产木聚糖酶菌株筛选方法的探讨 48-49 3.2 发酵过程中pH的变化和控制 49 3.3 粗酶液性质 49-50 4 本章小结 50-52 4.1 菌株Z1f的最佳产酶条件 50-51 4.2 菌株Z1f所产木聚糖酶的酶学性质 51-52全文结论 52-54 1 产木聚糖酶菌株的筛选和鉴定 52 2 菌株Z1f的最佳产酶条件 52 3 菌株Z1f所产木聚糖酶的酶学性质 52-54参考文献 54-64附录1 木聚糖酶的测定方法 64-67附录2 PBS缓冲液的配方 67-68附录3 革兰氏染色法 68-69附录4 数据表格 69-72致谢 72

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