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抗蚜虫PPA基因高效表达载体构建及其在小麦原生质体中的表达验证

作　者: 袁媛
导　师: 魏景芳
学　校: 河北科技大学
专　业: 植物学
关键词: 真核表达载体 植物凝集素 PPA基因 泛素 原生质体 瞬时表达
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


虫害是威胁农业生产的一个世界性问题,利用转基因技术创造新的抗虫植物品系对农业害虫防治、环境保护及农业可持续发展具有重要意义。目前国内对于植物凝集素抗虫基因转化研究大多集中于雪花莲凝集素(Galanthus nivalis Agglutinin,GNA)基因。天南星科半夏属的掌叶半夏为我国特有的中草药,掌叶半夏块茎的粗提液对蚜虫有强致死作用,粗提液的主要成分是植物凝集素蛋白(Pinellia pedatisecta agglutinin,PPA)。转半夏凝集素基因的烟草具有比转雪花莲凝集素基因更强的抗桃蚜活性。在单子叶植物中应用较广的为玉米泛素启动子Ubi,它有着启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等优点,Ubi启动子在转基因小麦中有较高活性,表达效率可达到CaMV35S启动子的4-5倍。绿色荧光蛋白(GFP)是源于海洋生物水母属(Aequorea Victoria)的一种发光蛋白,它作为报告分子有许多优点:稳定、灵敏度高、荧光反应不需要任何底物及辅助因子,使表达检测非常简单,同时它在细胞中自主表达、没有种属特异性、对受体细胞无毒性、对目的基因没有影响。本试验的目的是将PPA基因连接到植物表达载体pCAMBIA1380上(以Ubi为启动子、GFP为报告基因),从而构建出一个抗蚜虫的高效植物表达载体,为小麦的遗传转化奠定材料基础,为植物特别是农作物害虫防治提供了新的基因资源。本文运用基因工程技术对掌叶半夏凝集素PPA基因进行改造,并将其转入真核表达载体,得到以下成果:1、成功构建植物高效表达载体pUGP,该载体包含玉米泛素启动子Ubi、掌叶半夏凝集素PPA基因和绿色荧光蛋白GFP基因,为后续的蛋白表达实验和功能实验提供实验平台和基础材料。2、成功制备小麦原生质体,并对其进行了表达验证。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第1章 绪论  8-20
  1.1 植物凝集素  9-13
    1.1.1 植物凝集素定义  10
    1.1.2 植物凝集素的结构及分布  10
    1.1.3 植物凝集素的功能  10-12
    1.1.4 植物凝集素的作用机理  12
    1.1.5 掌叶半夏  12
    1.1.6 掌叶半夏凝集素（PPA）  12-13
  1.2 玉米泛素启动子  13-15
    1.2.1 泛素启动子的结构特征  13-14
    1.2.2 泛素启动子的作用  14-15
  1.3 筛选标记基因GFP  15-18
    1.3.1 GFP 的结构特征  15-16
    1.3.2 GFP 的优点及应用  16-18
  1.4 本课题的内容及意义  18-20
第2章 Ubi、PPA、GFP 基因的克隆及pCAMBIA1380-UBI 的构建  20-34
  2.1 材料  20-22
    2.1.1 菌株与载体  20
    2.1.2 实验试剂与仪器  20-22
  2.2 实验方法  22-28
    2.2.1 PCR 扩增Ubi、PPA、GFP 片段  22-25
    2.2.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 扩增产物及回收纯化  25-26
    2.2.3 三种连T 克隆载体的构建及测序  26-28
  2.3 中间载体pCAMBIA1380-UBI 的构建  28-29
  2.4 结果  29-32
    2.4.1 蓝白斑筛选结果  29-31
    2.4.2 目的片段Ubi 的PCR 检测  31
    2.4.3 pCAMBIA1380-UBI 双酶切鉴定  31-32
  2.5 讨论与小结  32-34
第3章 中间载体pCAMBIA1380-UBI-PPA 的构建  34-40
  3.1 目的基因与载体的双酶切  34-35
  3.2 目的片度与载体的连接  35
  3.3 结果  35-38
    3.3.1 目的片段PPA 的PCR 检测  35-36
    3.3.2 pCAMBIA1380-UBI-PPA 的双酶切鉴定  36-37
    3.3.3 PPA 基因的序列分析  37-38
  3.4 讨论与小结  38-40
第4章 植物高效表达载体pUPG 的构建  40-46
  4.1 目的基因GFP 与中间载体的双酶切  40-41
  4.2 目的片度与载体的连接  41-42
  4.3 结果  42-44
    4.3.1 目的片段的PCR 检测  42-43
    4.3.2 pUPG 的双酶切鉴定  43-44
  4.4 讨论与小结  44-46
第5章 小麦原生质体的制备与转化  46-52
  5.1 小麦原生质体培养的意义及培养现状  46-47
    5.1.1 开拓遗传育种新途径  46
    5.1.2 植物遗传的良好受体  46
    5.1.3 小麦原生质体培养现状  46-47
  5.2 小麦原生质体的培养及转化  47-49
  5.3 瞬时转化检测  49-50
  5.4 讨论与小结  50-52
结论  52-53
附录  53-54
参考文献  54-60
致谢  60

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 麦 > 小麦
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