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Cullin-5表达下调对足细胞形态及增殖功能的初步影响

作　者: 曹璐
导　师: 毛建华
学　校: 浙江大学
专　业: 儿科学
关键词: 足细胞 Cullin-5 泛素蛋白酶系统蛋白降解足细胞损伤 RNA干扰基因敲低 RT-PCR Western-blot MTT 免疫荧光
分类号: R726.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

[研究背景]肾小球性蛋白尿发生的根本原因是由于肾小球滤过屏障受损,而肾小球上皮细胞则是保持肾小球滤过膜功能完整的关键因素。近十余年来的众多研究发现,很多先天性肾病综合征患者的发病是由于Nephrin、Podocin、α-Actinin-4、Synaptopodin、WT-1等蛋白质的编码基因突变引起的。上述基因Knock-out的模型动物也出现了蛋白尿及肾小球上皮细胞足突融合等病变,表明这些表达在肾小球上皮细胞的足突分子(如Nephrin、Podocin、CD2AP、TRPC6)及细胞骨架相关蛋白(如Synaptopodin、α-Actinin-4、Podocalyxin等)对维持肾小球滤过膜完整性、阻止血浆蛋白漏出起着重要作用。本研究小组近年来的研究也发现,Nephrin、Podocin、CD2AP等足突分子的表达及调控变化确实与部分中国原发性肾病综合征患儿的发病密切相关。同时我们还证实,Myole(一种肌球蛋白工类分子)也是人、小鼠肾小球上皮细胞的骨架相关蛋白,其表达Knock-down后斑马鱼可出现蛋白尿及肾小球上皮细胞结构变化。所有细胞的蛋白质都需要代谢和更新,真核细胞内蛋白质的调节和降解主要有两个途径：溶酶体途径和泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin Proteasome System,UPS).UPS由泛素、26S蛋白酶体、泛素活化酶E1s、泛素交联酶E2s、泛素连接酶E3s等组成,是高效、特异的蛋白质降解系统,是细胞调控特定蛋白质、去除错误折叠蛋白的主要机制。泛素连接酶E3s的主要作用是识别特定的需要被降解的靶蛋白,并把泛素转移到靶蛋白上,最后通过蛋白酶降解靶蛋白。Cullin-5(CUL5)是很多E3s-CRL的组分,参与多种靶蛋白(如p53)的降解。其编码基因(位于11q22-23)序列与精氨酸加压素激活钙转运受体-1(VACM-1)高度同源,所以这两者可能是同一种蛋白。迄今为止,已知CUL5/VACM-1的功能是：1、CUL5作为Backbone组装E3s,参与真核细胞胞内众多蛋白质的泛素化修饰及特异性降解；2、作为主要表达在血管内皮细胞的蛋白质,VACM-1在多个细胞株都表达出抑制细胞增殖的活性,具抗肿瘤效应。我们的前期研究表明,CUL5在人、小鼠肾小球上皮细胞有表达,其表达下调可导致模式动物斑马鱼出现蛋白尿。我们分析,CUL5表达下调可导致蛋白尿的机制可能与由此导致的以CUL5为基石的UPS功能异常,并最终引起足突分子及细胞骨架相关蛋白的代谢、转换和更新机制失调有关。[目的]研究CUL5敲低之后,小鼠的肾小球足细胞的形态和增殖的变化。阐明CUL5在维持足突分子和肾小球滤过屏障的功能中可能发挥的关键作用。[方法]1.小鼠肾小球足细胞培养。2.细胞免疫荧光法鉴定足细胞及细胞骨架蛋白。3. miRNA设计,针对CUL5的4个不同序列,分别设计四个质粒和一个阴性对照质粒。由Invitrogen公司合成。4.使用Invitrogen公司的转染试剂,对足细胞中的CUL5基因瞬时转染,敲低CUL5表达。5.应用RT-PCR方法来从mRNA水平,检测基因敲低的效果,以GAPDH作为内参基因,经过Geo-plo-Analyzer 4.0软件,分析凝胶电泳后图片,半定量分析基因表达差异。6.应用Western-blot方法从蛋白水平,检测基因敲低的效果,以(β-actin作为内参基因,经过Image J软件分析,半定量分析蛋白表达的差异。7.细胞免疫荧光法检测CUL5敲低之后足细胞形态学的变化。8.细胞免疫荧光法检测CUL5敲低之后细胞骨架蛋白的变化。9.MTT法检测各个实验组细胞的增殖情况,分别设定4个实验点,即24小时、48小时、72小时、96小时,检测细胞的OD值。[结果]1.小鼠足细胞,在33℃允许条件(permissive condition)下,增殖状态下的足细胞呈“鹅卵石”样。胞核呈圆形,位于胞体中央,足突较少较短；在转入37℃非允许条件(non-permissive condition)下,培养约14天的时间,足细胞分化成熟,胞质向四周伸展,形状不规则,有大量较长较细的足突形成,细胞呈“树枝”状。Nephrin作为鉴定足细胞内蛋白分子。2. 33℃允许条件下的足细胞,CUL5分布范围：主要集中在足细胞核膜的周围。37℃非允许条件下的足细胞,CUL5分布在细胞的胞浆和足突处。3. 33℃允许条件下的足细胞, F-actin分布范围：主要集中在足细胞主突附近;37℃非允许条件下的足细胞,F-actin呈放射状,伸展至新生的突起中。4.经过RNAi技术后,敲低CUL5,经过RT-PCR的检测mRNA的相对表达变化：干扰一组(P=0.003)、二组(P=0.042)、三组(P=0.000)、四组(P=0.000)与对照组有差异P<0.05;阴性对照组与对照组无明显差异,P=0.091。5.敲低CUL5后,用Western-blot检测蛋白的相对表达变化：干扰一组、二组、三组、四组与对照组有差异P<0.05；阴性对照组与对照组无明显差异,P=0.051。6.敲低CUL5之后,免疫荧光法检测细胞中荧光变化的情况,各个干扰组细胞荧光强度明显变弱,而对照组和阴性对照组的荧光强度相差不大。7.敲低CUL5之后,足细胞形态上的变化：细胞胞体缩小、形状不规则、边缘不整齐、足突有融合8.敲低CUL5之后,足细胞的增殖情况的变化：各个干扰组的足细胞的增殖能力与对照组相比有显著差异,P<0.01;阴性对照组与对照组也有差异,但差异不明显。[结论]1.CUL5在足细胞的不同生长时期的分布不同。2.CUL5在维系足细胞正常形态中发挥着一定的作用。3.CUL5敲低后足细胞增殖能力明显下降,说明CUL5在维系足细胞正常功能方面也发挥着重要作用。

全文目录

致谢  4-5
中文摘要  5-10
Abstract  10-15
主要缩略语  15-16
目录  16-17
前言  17-20
1 主要仪器设备和试剂  20-25
2 实验材料和方法  25-36
3 结果  36-44
讨论  44-48
结论  48-49
参考文献  49-52
综述  52-62
  参考文献  59-62
作者简历及在读期间所取得的科研成果  62

Cullin-5表达下调对足细胞形态及增殖功能的初步影响

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