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那西肽产生菌的选育和发酵条件的研究

作　者: 秦艳飞
导　师: 薛正莲
学　校: 安徽工程大学
专　业: 微生物学
关键词: 那西肽 活跃链霉菌 诱变育种 原生质体 培养基优化 中试
分类号: TQ936.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


为了获得适应于工业化生产的那西肽高产菌株,以那西肽产生菌-活跃链霉菌CB040517为出发菌株,采用传统诱变育种、原生质体再生与物理诱变以及理性化筛选相结合的育种手段,获得了那西肽高产菌株,并对其发酵特性进行了研究。以那西肽产生菌-活跃链霉菌CB040517为出发菌株采用紫外诱变方法,获得产量相对稳定且相对高产的那西肽产生菌NXT-UV19 (754.16μg/mL),较原始菌株(524.06μg/mL)提高了43.91%。再以NXT-UV19为出发菌株,分别采用微波、激光和亚硝胍作为诱变手段,考察了三种诱变剂的诱变剂量与致死率的关系,确定最适诱变剂量,实验结果表明,激光照射孢子悬液2小时,诱变效果较好,正突变率高,并获得高产菌株NXT-UV19-J2,其效价达到(905.22μg/mL)。以激光诱变获得的高产菌株NXT-UV19-J2为出发菌株,然后用1000μg/ml的NTG,处理孢子悬液1小时后,以组合氨基酸(L-Glu1500μg/mL、L-Thr300μg/mL、L-Ser500μg/mL、L-Cys 300μg/mL、L-Trp1500μg/mL)做定向育种筛选子,获得3株高产菌株(NXT-UV19-J2-NA10、NXT-UV19-J2-NA36、NXT-UV19-J2-NA38),其中NXT-UV19-J2-NA10菌株在摇瓶中培养118 h,效价达1110.56μg/mL,比出发菌株(720.30μg/mL)提高了54.18%。对3株菌株的遗传稳定性进行了考察,结果表明,NXT-UV19-J2-NA10菌株的第五代生产能力为第一代的89.8%,其遗传性状比较稳定。对那西肽产生菌-活跃链霉菌的原生质体制备与再生进行了研究,考察了接种量、溶菌酶浓度、酶解时间等对原生质体制备、再生的影响。原生质体制备最优条件：菌丝体培养最佳接种量为12ml,酶浓度为2.0mg/ml,酶解时间为60min时有利于原生质体的制备。以NXT-UV19为出发菌种,研究了紫外、微波以及紫外-微波复合对活跃链霉菌原生质体的诱变效应。结果表明,复合诱变对该菌原生质体有明显的致死作用。通过紫外-微波复合诱变,筛选到一株优良菌株PUW-13,其摇瓶培养,那西肽产量达到886.67μg/mL,较出发菌种提高了17.43%。用响应面法对发酵培养基进行优化,确定最优培养基组分为淀粉7.0%、葡萄糖0.5%、酵母粉0.31%、黄豆粉6.42%、NaCl0.41%、硫酸铵0.1%、硝酸钾0.05%、CaCO30.4%、接种量5.5%、装液量40ml/500ml,用此培养基配比,摇瓶效价比优化前提高了10.95%,达到了1123.714μg/ml。对高产菌株NXT-UV-J2-NA10菌种进行中试验证,对培养工艺进行优化和发酵过程补料,延长发酵时间实验,以期达到提高发酵水平的目的,结果表明对发酵罐采取变温培养、通气流量采取分阶段控制,257小时放罐,发酵单位达到,220μg/mL,为工业化提供了参比条件。

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摘要  5-7ABSTRACT  7-16第一章 文献综述  16-25  1.1 那西肽研究历程及现  16  1.2 那西肽分子结构与理化性质  16-17  1.3 那西肽抗菌机制  17  1.4 那西肽的生物合成途径  17-19  1.5 那西肽的发酵生产  19-23    1.5.1 那西肽产生菌的菌种特性  19-20    1.5.2 诱变育种  20    1.5.3 那西肽的发酵工艺  20-21    1.5.4 那西肽的提取工艺  21-22    1.5.5 那西肽的分析检测方法  22-23  1.6 物理诱变与化学诱变主要方法  23-24  1.7 本论文研究意义与目标  24-25第二章 那西肽产生菌的孢子诱变育种  25-46  2.1 菌种筛选流程  25-26  2.2 实验材料  26-27    2.2.1 菌株  26    2.2.2 培养基  26      2.2.2.1 斜面及平板培养基(%)  26      2.2.2.2 种子培养基(%)  26      2.2.2.3 发酵培养基(%)  26    2.2.3 主要试剂  26    2.2.4 主要实验设备  26-27  2.3 分析方法  27-29    2.3.1 pH测定  27    2.3.2 PMV测定  27    2.3.3 还原糖测定  27-28    2.3.4 氨基氮含量测定  28-29    2.3.5 那西肽的含量测定  29  2.4 实验方法  29-32    2.4.1 单孢子悬液的制备  29-30    2.4.2 经典诱变-物理诱变方法的考察  30      2.4.2.1 紫外诱变  30      2.4.2.2 微波诱变  30      2.4.2.3 激光诱变  30    2.4.3 经典诱变-化学诱变方法的考察  30-31      2.4.3.1 助诱剂LiCL抗性实验  30      2.4.3.2 亚硝酸钠诱变  30-31      2.4.3.3 亚硝基胍(NTG)诱变  31    2.4.4 前体氨基酸抗性筛选  31    2.4.5 理性与推理选育-复合诱变  31-32      2.4.5.1 紫外和微波复合诱变  31-32      2.4.5.2 紫外诱变和氨基酸抗性筛选复合诱变那西肽产生菌  32      2.4.5.3 NTG诱变和组合氨基酸抗性复合育种  32    2.4.6 菌种保藏  32    2.4.7 培养条件  32      2.4.7.1 斜面及平板培养条件  32      2.4.7.2 种子瓶培养条件  32      2.4.7.3 发酵瓶培养条件  32    2.4.8 高产菌株的形态特征与传代稳定性  32      2.4.8.1 菌落形态特征比较  32      2.4.8.2 高产菌株的传代稳定性  32  2.5 结果与讨论  32-46    2.5.1 葡萄糖标准曲线  32-33    2.5.2 那西肽分光光度计法含量测定标准曲线  33    2.5.3 紫外诱变的致死率与正突变率  33-34    2.5.4 微波诱变  34-35    2.5.5 激光对那西肽产生菌孢子的诱变效应  35-37    2.5.6 助诱变剂LiCL抗性实验  37    2.5.7 亚硝酸钠诱变  37-38    2.5.8 亚硝基胍对那西肽产生菌孢子的诱变效应  38-40    2.5.9 理性与推理选育实验结果  40-44      2.5.9.1 氨基酸抗性实验  40-42      2.5.9.2 紫外和微波复合诱变  42-43      2.5.9.3 紫外诱变和氨基酸抗性筛选复合育种  43      2.5.9.4 NTG诱变和组合氨基酸抗性复合育种  43-44    2.5.10 高产菌株菌落形态演变谱系  44-46第三章 那西肽产生菌原生质体诱变  46-55  3.1 实验材料  46-47    3.1.1 菌株  46    3.1.2 培养基  46-47      3.1.2.1 斜面、母瓶、发酵培养基  46      3.1.2.2 菌丝体培养基  46-47      3.1.2.3 原生质体再生培养基  47    3.1.3 溶液配制  47      3.1.3.1 微量元素溶液  47      3.1.3.2 高渗稳定液P buffer  47      3.1.3.4 溶菌酶溶液  47    3.1.4 主要试剂  47  3.2 实验方法  47-49    3.2.1 活跃链霉菌-那西肽原生质体制备条件的研究  47-48      3.2.1.1 菌丝体培养  47-48      3.2.1.2 原生质体制备  48      3.2.1.3 原生质体再生  48    3.2.2 活跃链霉菌-那西肽原生质体诱变  48-49      3.2.2.1 原生质体紫外诱变  49      3.2.2.2 原生质体微波诱变  49      3.2.2.3 紫外-微波复合诱变  49  3.3 结果与讨论  49-54    3.3.1 菌丝体培养最佳接种量的确立  49-50    3.3.2 原生质体制备及再生的优化  50    3.3.3 紫外和微波分别对那西肽产生菌原生质体的诱变  50-52    3.3.4 紫外-微波复合诱变效应  52-54  3.4 那西肽高产菌株的诱变谱系  54-55第四章 那西肽发酵条件优化及中试放大  55-74  4.1 实验材料  55-57    4.1.1 菌种  55    4.1.2 培养基  55      4.1.2.1 种子罐培养基  55      4.1.2.2 发酵罐培养基  55    4.1.3 主要原材料  55-56    4.1.4 发酵主要原材料质量控制指标  56-57    4.1.5 主要实验设备  57  4.2 试验方法  57-58    4.2.1 斜面、母瓶培养条件  57    4.2.2 种子罐培养工艺指标  57-58    4.2.3 发酵罐培养工艺指标  58  4.3 结果与分析  58-67    4.3.1 斜面和母瓶培养工艺局部改变  58-60      4.3.1.1 高产菌株斜面保藏时间的考察  58-59      4..3.1.2 母瓶种子液保藏时间对发酵放瓶效价的影响  59      4.3.1.3 种子移种时间对发酵的影响  59-60      4.3.1.4 高产突变株NXT-UV19-J2-NA10代谢特性的研究  60    4.3.2 摇瓶发酵培养基的优化  60-65      4.3.2.1 Plackett-Burman设计法  60-62      4.3.2.2 响应面分析法优化培养基的组成  62-65    4.3.3 发酵培养基添加有机氮源实验  65-66    4.3.4 发酵初始培养基补加氨基酸对发酵产物的影响  66-67  4.4 中式放大条件的研究  67-74    4.4.1 成熟母瓶菌丝形态  67-68    4.4.2 种子罐接种量的考察  68    4.4.3 种子罐按0.2%接种量不同时间菌丝形态  68    4.4.4 发酵罐接种量的考察  68-69    4.4.5 发酵罐的工艺控制  69-70      4.4.5.1 两级培养  69-70      4.4.5.2 三级发酵  70    4.4.6 发酵罐基础料添加氨基酸和玉米蛋白粉实验  70-71    4.4.7 两级发酵过程菌丝形态  71-72    4.4.8 根据溶氧调整温度和空气通气量  72    4.4.9 调整后的发酵培养工艺  72-74第五章 结论与展望  74-76  5.1 结论  74-75  5.2 展望  75-76参考文献  76-80学位论文研究工作期间发表的文章  80-81致谢  81

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 蛋白质（朊）化学加工工业 > 化学加工过程 > 蛋白质水解及中间产物 > 多肽
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