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水稻叶绿体表达载体的构建及遗传转化

作　者: 谢灵灵
导　师: 曹孟良
学　校: 中南大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 水稻叶绿体表达载体原核表达瞬时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

叶绿体转化技术具有诸多优点,但是该技术在水稻上的应用较少。本实验中,分别克隆了水稻叶绿体表达载体的不同元件,以水稻总DNA为模板,PCR扩增了叶绿体基因组同源重组片段trnl和trnA,与GenBank中水叶绿体基因组比对,同源性分别达到99.93%和100%；以载体pEGFP-N2为模板,PCR扩增了具有3种含不同RBS序列的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)；烟草叶绿体启动子Prrn和终止子TpsbA克隆自载体pLM21,与GenBank中烟草叶绿体基因组比对,同源性分别达到97.35%和100%。构建了3种能编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的水稻叶绿体转化载体pIA-EGFP1、pIA-EGFP2和pIA-EGFP3并进行了酶切检测。将上述所构建载体电转入大肠杆菌,观察了大肠杆菌内egfp的表达情况,结果显示,携带的RBS来源于λ噬菌体T7 gene 10的5’UTR的载体pIA-EGFP3荧光最强。以载体pCAMBIA1301为模板,PCR扩增了RBS为T7 gene 10的5’UTR的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt),并将该片段连入了载体pIA-EGFP3,构建了载体pIA-EGFP3-HPT,将载体电转入大肠杆菌后检测了潮霉素抗性,转化成功的大肠杆菌具有潮霉素抗性。将载体pIA-EGFP3-HPT通过基因枪轰击洋葱表皮细胞,观察egfp的瞬时表达,结果在洋葱表皮细胞中观测到了明显的绿色荧光,说明载体pIA-EGFP3-HPT在洋葱质体中成功表达,因此认为载体pIA-EGFP3-HPT适合用于水稻叶绿体转化,目前烟草的转叶绿体技术比较成熟,且扩增得到的同源片段与叶绿体基因组有较高的同源性,因此将载体轰击烟草叶片。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
第一章绪论  10-18
  1.1 叶绿体基囚组  10-12
  1.2 叶绿体转化的发展历程  12
  1.3 叶绿体遗传转化的优点  12-13
    1.3.1 母性遗传  12
    1.3.2 表达量高  12-13
    1.3.3 定点表达  13
    1.3.4 多顺反子表达  13
  1.4 叶绿体表达载体  13-16
    1.4.1 同源片段  13-14
    1.4.2 叶绿体启动子和终止子  14
    1.4.3 叶绿体遗传转化筛选标记  14-16
    1.4.4 转入叶绿体的外源基因  16
  1.5 外源基因导入叶绿体  16-17
  1.6 叶绿体基因组的同质化  17
  1.7 研究的目的与意义  17-18
第二章研究内容及技术路线  18-19
第三章实验材料  19-21
  3.1 植物、菌株和载体  19
  3.2 试剂与试剂盒  19
  3.3 生物信息学分析软件  19
  3.4 实验所用引物  19-21
    3.4.1 同源片段trnI和trnA引物  19-20
    3.4.2 增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)的引物  20
    3.4.3 烟草叶绿体启动子和终止子引物的设计  20
    3.4.4 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)引物的设计  20-21
第四章实验方法  21-33
  4.1 水稻总DNA的提取  21
  4.2 大肠杆菌DH10B感受态的制备  21-22
  4.3 水稻叶绿体同源片段trnI和trnA扩增和克隆  22-23
  4.4 增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)的扩增和克隆  23-24
  4.5 烟草叶绿体启动子和终止子的扩增与克隆  24-25
  4.6 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的扩增与克隆  25
  4.7 水稻叶绿体表达载体的构建  25-30
    4.7.1 含egfp基因的水稻叶绿体表达载体的构建  25-27
    4.7.2 含egfp和hpt的水稻叶绿体表达载体的构建  27-28
    4.7.3 载体pIA-EGFP3-HPT的大量抽提  28-29
    4.7.4 载体pIA-EGFP3-HPT基因枪轰击洋葱表皮细胞  29-30
  4.9 载体pIA-EGFP3-HPT转化水稻愈伤组织  30-31
    4.9.1 水稻胚性愈伤组织的诱导  30
    4.9.2 愈伤组织的预培养  30-31
    4.9.3 基因枪转化水稻愈伤组织  31
    4.9.4 抗性愈伤的筛选  31
  4.10 载体pIA-EGFP3-HPT转化烟草叶片  31-33
    4.10.1 烟草无菌苗的获得  31
    4.10.2 烟草叶片的预处理  31
    4.10.3 基因枪转化烟草叶片  31-32
    4.10.4 抗性愈伤的筛选  32-33
第五章结果与分析  33-43
  5.1 水稻叶绿体同源片段trnI和trnA扩增和克隆  33-36
    5.1.1 扩增PCR扩增的同源片段trnI和trnA的电泳检测  33
    5.1.2 同源片段trnI和trnA克隆的测序分析  33-36
  5.2 PCR扩增的egfp片段的电泳检测  36-37
  5.4 烟草叶绿体启动子Prrn和终止子TpsbA的扩增与克隆  37-39
    5.4.1 PCR扩增的Prrn片段和TpsbA片段的电泳检测  37-38
    5.4.2 Prrn片段和TpsbA片段的测序分析  38-39
  5.5 PCR扩增的hpt片段的电泳检测  39
  5.6 构建的水稻叶绿体表达载体的检测  39-41
    5.6.1 含egfp的水稻叶绿体转化载体的酶切验证  39-40
    5.6.2 基因枪转化的大肠杆菌的荧光观察  40-41
    5.6.3 水稻叶绿体转化载体pIA-EGFP3-HPT的潮霉素抗性检测  41
  5.7 载体pIA-EGFP3-HPT在洋葱表皮细胞中的瞬时表达  41-42
  5.8 水稻抗性愈伤的筛选  42
  5.9 烟草抗性愈伤的筛选  42-43
第六章讨论  43-46
  6.1 同源片段的选择  43
  6.2 外源基因的表达  43-44
    6.2.1 egfp的表达  44
    6.2.2 hpt作为筛选标记  44
  6.3 外源基因的烟草叶绿体中的稳定整合  44
  6.4 水稻叶绿体转化技术  44
  6.5 水稻叶绿体转化技术的展望  44-46
参考文献  46-51
附录1 仪器设备  51-52
附录2 试剂配方  52-54
附录3 缩略词  54-55
致谢  55-56
作者在学期间取得的学术成果  56

水稻叶绿体表达载体的构建及遗传转化

内容摘要

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