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人双艾柯病毒间接ELISA和荧光定量PCR检测方法的建立

作　者: 余莹
导　师: 华修国
学　校: 上海交通大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 人双艾柯病毒 VP1 原核表达间接ELISA 荧光定量PCR
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

根据HPeV衣壳蛋白VP1基因设计引物,扩增出696bp大小的目的片段,并将其克隆到pET-28a表达载体上,经酶切、测序鉴定后,将该质粒转化入E.coli Rosetta (DE3)中,通过IPTG诱导、SDS-PAGE检测结果显示,VP1基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达。以盐酸胍溶解液溶解包涵体蛋白,用Ni-NTA柱对重组蛋白进行纯化,4℃条件下复性。经Western-blot检测表明,该重组蛋白能被HPeV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。用表达的VP1重组蛋白作为包被抗原,建立了检测抗HPeV抗体的间接ELISA方法。经对ELISA的最佳工作条件测定结果表明,抗原最佳包被浓度为3.7μg?ml-1,最适包被条件为37℃2h后4℃过夜,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,待检血清最佳稀释度为1:400,最适作用条件为37℃1h,羊抗人IgG最佳稀释度为1:5000,最佳显色时间为10min,阴阳性临界值为0.1701。经重复性试验和特异性实验结果显示,建立的ELISA方法具有良好的可重复性;与猪链球菌2型、人星状病毒、人博卡病毒、戊型肝炎病毒阳性血清抗体均无交叉反应。利用已建立的ELISA方法检测257份临床儿童血清样品,检出HPeV总阳性率为73%。根据HPeV八个基因型的参考毒株全序列,针对5‘端非编码区保守序列设计特异性引物,经过反应条件的优化,建立了SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,并与常规套式RT-PCR检测方法进行比较。结果表明,建立的标准曲线Ct值与模板浓度呈现良好的线性关系(r2=0.999),融解曲线特异,检测灵敏度可达60拷贝/μl,比常规PCR检测方法高100倍,重复性变异系数小(<1%),能特异地检测HPeV。临床样本检测结果也表明该法(检出30份)灵敏度高于套式RT-PCR(检出21份)。实验结果证明建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望成为HPeV的分子诊断、流行病学调查等相关研究的工具。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-6
符号说明  6-7
目录  7-10
第一章文献综述  10-23
  1 人双艾柯病毒的研究进展  10-22
    1.1 病原学  11-15
    1.2 流行病学  15-16
    1.3 HPeV 的检测方法  16-22
  2 本研究的目的和意义  22-23
第二章HPeV VP1 基因的原核表达及其产物的抗原性分析  23-42
  1 材料  23-24
    1.1 毒株、菌株和质粒  23
    1.2 血清  23-24
    1.3 主要试剂  24
    1.4 主要仪器  24
  2 方法  24-33
    2.1 病毒总RNA 的提取  24-25
    2.2 引物的设计与合成  25
    2.3 套式RT-PCR 及靶基因VP1 的扩增  25-27
    2.4 目的片段的纯化回收  27-28
    2.5 目的基因的克隆  28-29
    2.6 原核表达载体pET-28a-VP1 的构建  29-31
    2.7 重组表达载体的诱导表达  31-32
    2.8 表达产物的纯化  32
    2.9 表达产物的复性  32
    2.10 纯化产物的Western blot 鉴定  32-33
  3 结果  33-39
    3.1 VP1 基因的PCR 结果  33-34
    3.2 目的基因的克隆鉴定  34
    3.3 重组表达质粒的鉴定  34-35
    3.4 蛋白的原核表达  35-37
    3.5 蛋白的可溶性分析  37
    3.6 蛋白的纯化与复性  37-38
    3.7 蛋白的Western blot 分析  38-39
  4 讨论  39-42
第三章HPeV 间接ELISA 检测方法的建立及初步应用  42-56
  1 材料  42-43
    1.1 抗原的制备  42
    1.2 血清  42-43
    1.3 主要试剂  43
    1.4 主要仪器  43
  2 方法  43-46
    2.1 间接ELISA 方法的基本操作程序  43
    2.2 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择  43-44
    2.3 抗原包被条件的选择  44
    2.4 封闭液及封闭时间的选择  44-45
    2.5 血清作用时间的选择  45
    2.6 酶标二抗最佳稀释度的选择  45
    2.7 底物显色时间的选择  45
    2.8 阴阳性临界值的确定  45
    2.9 特异性试验  45-46
    2.10 重复性试验  46
    2.11 间接ELISA 与微量中和实验比较  46
  3 结果  46-53
    3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定  46-47
    3.2 抗原包被条件的确定  47-48
    3.3 封闭液及封闭时间的确定  48-49
    3.4 血清最适作用时间的确定  49
    3.5 酶标二抗最佳稀释度的确定  49-50
    3.6 底物显色时间的确定  50
    3.7 阴阳性临界值的确定  50-51
    3.8 特异性试验  51
    3.9 重复性试验  51-52
    3.10 临床样品的检测  52-53
  4 讨论  53-56
第四章HPeV SYBR Green I 荧光定量PCR 检测方法的建立及初步应用  56-69
  1 材料  56-57
    1.1 阳性病料与临床样本  56-57
    1.2 主要试剂  57
    1.3 主要仪器  57
  2 方法  57-61
    2.1 引物的设计与合成  57-58
    2.2 病毒RNA 的提取及cDNA 的合成  58
    2.3 标准阳性模板的制备  58-60
    2.4 SYBR Green I 荧光定量PCR 反应体系的建立和优化  60
    2.5 标准曲线的建立  60
    2.6 SYBR Green I 荧光定量PCR 方法的评价  60-61
    2.7 SYBR Green I 荧光定量PCR 与套式RT-PCR 检测临床样品比较  61
  3 结果  61-67
    3.1 靶基因的扩增及标准品的定量  61-62
    3.2 SYBR Green I 荧光定量PCR 反应体系的确定  62
    3.3 标准曲线的绘制与融解曲线分析  62-64
    3.4 特异性评价  64-65
    3.5 敏感性评价  65-66
    3.6 重复性和稳定性  66-67
    3.7 临床样品检测  67
  4 讨论  67-69
第五章结论  69-70
参考文献  70-78
附录1 试剂配制  78-81
攻读学位期间发表的学术论文目录  81-82
致谢  82-84

人双艾柯病毒间接ELISA和荧光定量PCR检测方法的建立

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