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猪病毒性腹泻多重RT-PCR诊断方法的建立和应用及猪轮状病毒的分离

作　者: 张坤
导　师: 何启盖
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 病毒性腹泻多重RT-PCR PEDV TGEV PGAR 病毒分离 VP6和VP7基因克隆及序列分析
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

在寒冷季节,猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PGAR)是引起猪腹泻的主要病原,其临床症状、病理变化和流行病学极为相似,在临床和组织病理学上很难区分。本试验建立了能同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PGAR)的多重RT-PCR检测方法。根据GenBank登录的PEDV M基因、TGEV N基因、PGAR VP7基因,利用软件Primer 5.0设计合成三对特异性引物。经条件优化,我们建立了一种能够同时检测PEDV, TGEV和PGAR的多重RT-PCR的方法,并将这种方法和常规的RT-PCR进行了比较。特异性试验中,多重RT-PCR检测方法能够检测到35 pg的TGEV-PEDV-PGAR三联苗的混合RNA。在临床检测中,应用该方法检测了华中地区75份腹泻猪粪样,同时利用常规RT-PCR检测方法对该检测方法的敏感性和特异性进行了分析(PEDV、TGEV、PGAR敏感性分别为92%、100%、100%,特异性均为100%)。该方法敏感性高、特异性强,可用于腹泻样品中PEDV、TGEV和PGAR的检测。利用已建立的PEDV、TGEV、PGAR多重RT-PCR检测方法对2009年1月至2010年2月来自湖北、河南、湖南、江西、广西等地区部分养殖场的197份猪腹泻粪样进行了检测。结果为PEDV感染58份,占29.44%；TGEV感染1份,占0.51%；PGAR感染15份,占7.61%。哺乳仔猪、保育及育肥猪和母猪三个生长阶段进行了统计分析：在PEDV 58份阳性样品中哺乳仔猪占24.14%、保育及育肥猪占55.17%、母猪占20.69%; TGEV仅从哺乳仔猪检出、保育及育肥猪和母猪未检测出；PGAR 15份阳性样品中哺乳仔猪占13.33%、保育及育肥猪占6.67%、母猪占80.00%。检测结果显示：在寒冷季节,在本次收集的腹泻样品中猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起不同生长阶段猪病毒性腹泻最常见的病原,其次是猪A群轮状病毒。将三份轮状病毒阳性的腹泻猪粪样接种MA104细胞进行了轮状病毒分离,盲传至第三代开始出现明显细胞病变(CPE),将分离毒株依次命名为：TM-a毒株、WH-a毒株和GX-a毒株。对分离病毒进行了常规RT-PCR鉴定；同时依据GenBank发表的猪A群轮状病毒的VP6和VP7基因序列各设计了一对引物,对三株分离毒株的VP6和VP7基因序列进行了克隆及序列分析。结果显示TM-a株VP6基因与中国武汉人源A群R479毒株亲缘关系更为接近(94.4%),而与其VP7基因序列亲缘性最近的是印度人源A群RMC321毒株(95.1%)；WH-a株VP6基因与中国北京人源A群LL3354毒株亲缘关系更为接近(96.0%),而与其VP7基因亲缘性最近的的是印度人源A群RMC321毒株(94.6%)；GX-a株VP6基因与泰国猪源A群CMP74/01毒株的亲缘性最近(94.4%)。这些进一步证实分离的三株病毒为A群猪轮状病毒以及轮状病毒的多样性和复杂性。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略词(Abbreviation)  12-14
第1章猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用  14-35
  1 文献综述  14-24
    1.1 猪传染性胃肠炎病毒分子生物学特性及诊断方法研究进展  14-18
      1.1.1 猪传染性胃肠炎概述  14
      1.1.2 猪传染性胃肠炎的临床症状及病理变化  14-15
      1.1.3 猪传染性胃肠炎病毒的分子生物学特征  15-16
      1.1.4 猪传染性胃肠炎诊断方法研究进展  16-18
    1.2 猪流行性腹泻病毒分子生物学特性及诊断方法研究进展  18-20
      1.2.1 猪流行性腹泻概述  18
      1.2.2 猪流行性腹泻的临床症状及病理变化  18-19
      1.2.3 猪流行性腹泻病毒的分子生物学特征  19
      1.2.4 猪流行性腹泻检测技术研究进展  19-20
    1.3 猪轮状病毒分子生物学特性及诊断方法研究进展  20-24
      1.3.1 轮状病毒概述  20-21
      1.3.2 猪轮状病毒的临床症状及病理变化  21
      1.3.3 轮状病毒的分子生物学特征  21-22
      1.3.4 猪轮状病毒检测技术研究进展  22-23
      1.3.5 猪轮状病毒的培养特性  23-24
  2 研究的目的与意义  24
  3 材料与方法  24-27
    3.1 病毒  24
    3.2 临床病料  24
    3.3 试剂  24-25
    3.4 引物设计合成  25
    3.5 病料的处理  25
    3.6 RNA的提取  25
    3.7 反转录合成cDNA  25-26
    3.8 单项PCR扩增cDNA模板  26
    3.9 单项PCR最佳退火温度及引物浓度的确定  26
    3.10 多重RT-PCR反应条件优化  26
      3.10.1 多重PCR引物浓度及退火温度的优化  26
      3.10.2 多重PCR特异性和敏感性试验  26
    3.11 多重RT-PCR检测方法的初步临床应用  26
    3.12 多重RT-PCR产物测序及序列分析  26-27
    3.13 多重PCR检测结果的判定  27
  4 结果  27-33
    4.1 单项PCR退火温度及引物浓度的确定  27-28
    4.2 多重PCR反应条件的优化  28-29
    4.3 多重PCR最终反应条件  29
    4.4 多重RT-PCR的特异性  29-30
    4.5 多重RT-PCR的敏感性  30
    4.6 多重RT-PCR初步临床检测结果与常规RT-PCR比较  30-31
    4.7 多重RT-PCR产物的序列分析  31
    4.8 TGEV、PEDV和PGAR的流行病学调查  31-33
  5 讨论  33-35
第2章猪A群轮状病毒的分离与鉴定  35-48
  1 研究的目的与意义  35-36
  2 材料与方法  36-37
    2.1 材料  36-37
      2.1.1 病料  36
      2.1.2 细胞、宿主菌与载体  36
      2.1.3 主要试剂  36
      2.1.4 引物  36-37
  3 方法  37-42
    3.1 细胞培养液配制  37
    3.2 病料的处理及接种  37
    3.3 病毒的RT-PCR鉴定  37
    3.4 RNA的提取  37-38
    3.5 反转录合成cDNA  38
    3.6 PCR扩增cDNA模板  38
    3.7 DNA回收  38-39
    3.8 克隆质粒的构建  39
    3.9 构建质粒的PCR鉴定  39
    3.10 构建质粒的酶切鉴定  39-40
    3.11 VP6和VP7基因的测序  40
    3.12 VP6基因序列分析  40-42
  4 结果与分析  42-47
    4.1 病毒的分离  42-43
    4.2 病毒的RT-PCR鉴定  43
    4.3 VP6和VP7基因的RT-PCR扩增  43
    4.4 VP6和VP7克隆质粒的构建与鉴定  43-44
    4.5 VP6基因序列测序结果  44
    4.6 VP7基因序列测序结果  44
    4.7 VP6基因序列的同源性分析  44-45
    4.8 VP7基因序列的同源性分析  45-47
  5 讨论  47-48
第3章结论  48-49
参考文献  49-59
附录  59-65
致谢  65

猪病毒性腹泻多重RT-PCR诊断方法的建立和应用及猪轮状病毒的分离

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