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猪流行性腹泻病毒重组沙门氏菌的构建及免疫原性分析

作　者: 徐丽丽
导　师: 何启盖
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流行性腹泻病毒(PEDV) COE基因 SD基因猪霍乱减毒沙门氏菌新型疫苗
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)所引起的,以急性肠炎和水泻为特征的肠道传染病,对哺乳仔猪危害最为严重,死亡率在95%以上,该病在世界范围内流行,给养猪业带来重大经济损失。肠道黏膜免疫细胞所产生的分泌型抗体(sIgA)是抵抗PEDV感染的有效抗体。因此,研制一种能够有效的刺激黏膜免疫系统产生局部免疫应答和全身免疫反应的疫苗,对防治PED具有重要意义。PEDV S基因的保护性抗原基因(COE基因,499～638aa)是诱导机体产生中和抗体的主要基因,此外,S1蛋白S1D(636～789aa)区包含了一个线性抗原表位(697～742aa)和两个B细胞表位(744～759aa和756～771aa),两者都是优秀的疫苗候选抗原。减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有可以有效递呈抗原,激发诱导抗沙门氏菌和外源抗原的全身免疫和黏膜免疫的优点。本研究以减毒猪霍乱沙门氏菌△asd C500缺失株(命名为C501)作为呈递抗原的活菌载体,以PEDV COE基因和SD基因为靶基因,分别构建重组减毒沙门氏菌,并测定其的免疫原性,以期得到一种预防猪流行性腹泻的基因工程活疫苗。主要研究内容包括：1重组猪霍乱减毒沙门氏菌的构建及鉴定参考已经发布的PEDV CV777株(Genebank NO. AF353511),设计特异性引物。利用PCR技术,从阳性病料中扩增出约480 bp的COE基因和462 bp的SD基因,序列比对结果表明, COE基因和SD基因序列与CV777株相应序列同源性均高达97%,且与其它已发布的不同PEDV毒株的基因序列同源性也均在91%以上。将扩增得到得的目的基因克隆到无抗性表达质粒pYA3493中,构建无抗性原核质粒pYA-COE和pYA-SD,然后将该质粒电转化入减毒猪霍乱沙门氏菌A asd C500缺失株中,构建重组减毒沙门氏菌菌株C501-COE和C501-SD,并经PCR和测序鉴定,测序结果显示该重组菌中的外源片段序列无突变和移码,显示构建成功。2重组菌的生物学特性研究本研究对构建的重组沙门氏菌进行了生物学特性鉴定(分泌表达、生长特性、表型特征及遗传稳定性)。重组菌中蛋白的表达及表达蛋白的定位通过Westernblotting和间接免疫荧光进行鉴定,Western blotting结果显示该重组菌可在17.8 kD和17kD处检测到特异性的反应条带,且间接免疫荧光实验结果显示重组菌中所表达的外源蛋白主要定位于菌体表面。目的蛋白在减毒沙门氏菌菌体表面得到表达的同时并未影响沙门氏菌自身的生长特性,亲本菌株和重组菌在37℃恒温培养11 h以后,其OD600均可达到1.0左右；经表型鉴定和传代培养试验鉴定得知,该重组菌不仅保留了与亲本菌株C500相同的生化特性,重组菌在经过连续50代传代以后仍可从重组菌中扩增到目的基因,且测序结果也显示了目的基因未发生任何突变。3重组菌对小鼠的免疫效力研究为评价重组菌C501-COE和C501-SD作为PED新型重组疫苗的免疫效力,本实验将1.5×108CFU/只的剂量,分别以口服和肌肉注射的方式免疫接种BALB/c小鼠,利用间接ELISA的方法和SYBR定量PCR的方法检测各种免疫学指标,实验结果如下：①sIgA产生情况,重组菌C501-COE和C501-SD口服免疫组sIgA抗体滴度分别为1：1280和1：2048,而肌肉注射组的sIgA抗体滴度分别为1：640和1：1024；②血清IgG抗体产生情况,重组菌C501-COE和C501-SD肌肉注射组中的IgG抗体滴度分别为1：4096和1：2560,而口服免疫组所产生的IgG抗体滴度分别为1：2048和1：1280；③由体外刺激脾淋巴细胞时所产生的IFN-y水平来看两个重组菌的肌肉注射组也明显高于口服免疫组。以上结果充分显示两种不同免疫方法免疫重组菌时均可诱导一定程度的黏膜免疫和体液免疫,同时也能诱导一定水平的细胞免疫反应,但是口服免疫时可以诱导更高水平的黏膜免疫。4重组菌的初步临床效果观察将3×109CFU剂量的重组活疫苗口服健康的1日龄仔猪,连续观察一周,仔猪健活,未出现不良反应。对确诊为PED的猪场,给1日龄仔猪口服免疫重组疫苗后,猪场A的免疫组的腹泻率由100%下降到18%～30%,而猪场B的死亡率则由80%下降到8%～20%,结果显示了该重组疫苗具有较好的免疫预防效果。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
缩略词表  12-13
1. 文献综述  13-21
  1.1 猪流行性腹泻(PED)  13-15
    1.1.1 PEDV病原学特征  13-14
    1.1.2 PEDV抗原性  14
    1.1.3 PEDV基因组结构  14-15
    1.1.4 PEDV抗原表位  15
  1.2 PED免疫学特征  15-18
    1.2.1 感染抗体与免疫保护机制  15-16
    1.2.2 PED疫苗  16-18
  1.3 消化道黏膜免疫的研究进展  18
  1.4 减毒沙门氏菌作为口服疫苗载体的研究进展  18-20
    1.4.1 沙门氏菌疫苗研究进展  19
    1.4.2 弱毒沙门氏菌作为疫苗载体的研究进展  19-20
  1.5 减毒沙门氏菌载体在基因免疫中的应用  20-21
2. 研究的目的与意义  21-22
3. 材料与方法  22-46
  3.1 材料  22-27
    3.1.1 质粒、菌株和抗体  22-23
    3.1.2 实验动物  23
    3.1.3 主要试剂、药品与试剂盒  23-24
    3.1.4 所需主要实验器材  24
    3.1.5 主要培养基及缓冲液的配制  24-26
    3.1.6 引物的设计与合成  26-27
  3.2 实验方法  27-46
    3.2.1 PEDV COE基因和SD基因的扩增  27-29
    3.2.2 PCR产物的回收与纯化  29-30
    3.2.3 目的基因的克隆及测序  30
    3.2.4 PEDV COE和SD基因表达载体的构建和在大肠杆菌的表达  30-37
    3.2.5 重组表达质粒pYA-COE和pYA-SD的构建与鉴定  37
    3.2.6 沙门氏菌电转化感受态细胞的制备  37
    3.2.7 重组菌pYA-COE和pYA-SD质粒的大景提取  37-38
    3.2.8 重组减毒沙门氏菌C501-COE和C501-SD的构建与鉴定  38-39
    3.2.9 重组菌株C501-COE和C501-SD的生物学特性研究  39-41
    3.2.10 重组菌株C501-COE和C501-SD小鼠免疫试验  41-45
    3.2.11 重组菌株的初步临床保护效果观察  45-46
4 结果与分析  46-60
  4.1 PEDV COE基因和SD基因的扩增及原核表达质粒的构建与鉴定  46-47
  4.2 重组减毒沙门氏菌C501-COE和C501-SD的构建与鉴定  47-50
    4.2.1 重组质粒pYA-COE和pYA-SD的构建与鉴定  47-48
    4.2.2 重组菌株C501-COE和C501-SD的构建与鉴定  48-50
  4.3 重组菌株C501-COE和C501-SD的生物学特性鉴定  50-52
    4.3.1 COE基因和SD基因在重组菌中的表达  50
    4.3.2 重组菌株生长特性研究  50-51
    4.3.3 重组菌株的表型鉴定  51-52
    4.3.4 重组菌株的遗传稳定性  52
  4.4 重组菌株的免疫原性检测  52-58
    4.4.1 COE蛋白和SD蛋白的抗体检测  52-55
    4.4.2 沙门氏菌抗体检测  55-57
    4.4.3 细胞免疫检测  57-58
  4.5 重组疫苗菌株的初步临床效果观察  58-60
    4.5.1 重组疫苗的安全性试验  58-59
    4.5.2 重组疫苗预防效果观察  59-60
5 讨论  60-64
  5.1 构建重组减毒沙门氏菌表达系统目的基因片段的选择  60-61
  5.2 减毒沙门氏菌asd载体-宿主平衡致死系统  61
  5.3 COE基因和SD基因在Aasd C500缺失株平衡致死系统中的表达  61-62
  5.4 重组沙门氏菌C501-COE和C501-SD在小鼠体内诱导的保护性免疫  62
  5.5 重组疫苗的临床初步应用  62-64
6 结论  64-65
参考文献  65-73
致谢  73

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