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双砷染料—四半胱氨酸系统在蛋白质标记检测以及定量分析方面的应用

作　者: 杨航
导　师: 何进
学　校: 华中农业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 双砷染料-四半肤氨酸系统增强型绿色荧光蛋白高效液相色谱毛细管区带电泳胶束电动毛细管电色谱蛋白质的标记与定量烯酞ACP还原酶(FabI) 酞基载体蛋白
分类号: Q51-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究蛋白质在细胞内的定位、分布,以及含量变化对了解其功能,揭示其作用机制具有重要意义。以绿色荧光蛋白为代表的生物标签将细胞显影方面的研究推向了高潮。但是由于空间效应的限制,荧光蛋白及其衍生物也表现出了其固有的局限性。这样,许多化学小分子荧光标签得到了广泛的发展和应用。双砷染料-四半胱氨酸(TC)系统就是其中的成功者。该系统不仅能用于活细胞体内的研究和分析,而且具有许多其它优点：(1)体积较小,不会影响到标记蛋白的物理折叠和生物活性。(2)特异性高,背景信号低。(3)能够作为定量分析工具使用。虽然TC标签被广泛的应用,但是染料与TC模体之间在极端条件下的结合稳定性以及其在定量分析方面的潜力,依然值得关注。本研究以烯酰-酰基载体蛋白(ACP)还原酶(FabI)为例,对该问题进行了系统的探索。FabI是细菌脂肪酸生物合成途径中催化延伸反应最后一步还原反应的酶,也是筛选新型抗菌药物的重要靶点。在此,我们分别构建了N端、C端、或者两端带TC标签的FabI,以及N端带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的FabI和没有标记的FabI作为研究对象(分别记为Nt-FabI、Ct-FabI、Bt-FabI、Gt-FabI和Wt-FabI)。通过体外酶活力测试,表明EGFP标记的FabI失去了酶活力,而带有TC标签的FabI与野生型的FabI (Wt-FabI)一样具有明显的酶活力。这表明TC标签没有影响靶蛋白的功能。纯化的FabIs与双砷染料结合后酶活力均有所下降,而尤以Wt-FabI下降最为明显。此外,我们还分别在加热、高压(由高效液相色谱HPLC提供)、高场强(由毛细管电泳CE提供)、微波处理和超声波处理等环境下检测了染料与TC标签的结合稳定性。结果表明,在70℃加热10 min,在5.24 MPa的高压下,在397 V/cm的高场强以及80 W的超声波处理30 min等条件下,二者之间的结合是稳定的。而微波(750 W)对染料与标签之间的结合所表现出的破坏作用随时间而增强。当处理时间达15 min时,能观察到明显的破坏作用,当处理时间延长至25 min时几乎完全破坏了二者之间的结合。在此基础上,我们探讨了TC标签在不同条件下对靶蛋白的定量分析的检测限和灵敏度。在毛细管区带电泳(CZE)条件下,对TC标记的FabI检测限达到10-16 mol,在10-12～10-10 mol浓度范围内,呈明显的线性关系。在SDS-PAGE胶上,检测限低至1 ng(10-11 mol)。而直接用荧光分光光度计检测,检测限达到10-12 mol。这些充分说明了TC标签在靶蛋白的定量分析方面具有十分巨大的潜力。同时,我们又用TC标签对大肠杆菌超量表达的酰基载体蛋白(holo-ACP)进行了定量分析。在细菌中,直接由acpP基因表达的是没有活性的apo-ACP,只有经过酰基载体蛋白合成酶(AcpS)的修饰后才能成为有活性的holo-ACP,在脂肪酸的生物合成中传递各种中间产物。在这部分工作中,我们构建了四种表达菌株Hh02：BL21(DE3)/pB-lu-ACP & pET-AcpS; Hh04:BL21(DE3)/pB-lu-ACP-AcpS; Hh06: BL21(DE3)/pB-lu-ACP-AcpS & pET-AcpS; Hh08:BL21(DE3)/pB-lu-ACP。四种表达菌株带有的不同质粒可以使细胞内的apo-ACP和holo-ACP以不同的比例存在,这样可以方便后续的分析检测。试验中用胶束电动毛细管电色谱(MEKC)来分析各菌株诱导表达后细胞裂解液中的apo-ACP和holo-ACP。结果表明在电泳条件下这两种在SDS-PAGE胶上不能分开的蛋白质可以得到很好的分离,并且具有很高的特异性。电泳图谱中并没有出现背景信号。最后,以异硫氰酸荧光素(FITC)为内参,计算出了各菌株所表达的holo-ACP的量。体外反应证实,被TC标记的ACP依然具有反应活性。这在MEKC中也得到了证实。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-13
缩略语表  13-15
第一章前言  15-21
  1.1 双砷染料-四半胱氨酸系统简介  15-18
  1.2 TC标签的应用  18
  1.3 TC标签与GFP标签比较  18-19
  1.4 其它化学标签  19-20
  1.5 本研究的目的和意义  20-21
第二章大肠杆菌烯酰ACP还原酶的标记及分析  21-47
  2.1 前言  21-22
  2.2 材料与方法  22-31
    2.2.1 主要仪器与试剂  22-23
    2.2.2 培养基  23
    2.2.3 分子克隆方法  23-27
      2.2.3.1 质粒抽提  23-24
      2.2.3.2 总DNA抽提  24-25
      2.2.3.3 目的片段的PCR扩增  25
      2.2.3.4 PCR纯化以及切胶回收  25
      2.2.3.5 酶切  25
      2.2.3.6 连接反应  25-26
      2.2.3.7 转化感受态细胞  26
      2.2.3.8 转化子验证  26
      2.2.3.9 序列测定与比对  26
      2.2.3.10 琼脂糖凝胶电泳  26-27
    2.2.4 载体构建  27-28
      2.2.4.1 pB-lumio的构建  27
      2.2.4.2 pB-lu-fabI的构建  27
      2.2.4.3 pET-Nt-fabI的构建  27
      2.2.4.4 pET-Wt-fabI的构建  27
      2.2.4.5 pET-Ct-fabI的构建  27-28
      2.2.4.6 pET-Bt-fabI的构建  28
      2.2.4.7 pET-Gt-fabI的构建  28
    2.2.5 菌种培养与蛋白纯化  28-29
      2.2.5.1 菌种培养  28
      2.2.5.2 Ni-NTA亲和纯化  28
      2.2.5.3 蛋白含量测定  28
      2.2.5.4 常规SDS-PAGE分析  28-29
    2.2.6 酶活测定方法  29
    2.2.7 体外染色  29
    2.2.8 体内染色  29
    2.2.9 CZE分析  29-30
    2.2.10 HPLC分析  30
    2.2.11 SPF分析  30
      2.2.11.1 微波处理  30
      2.2.11.2 超声波处理  30
    2.2.12 共聚焦显微镜分析  30
    2.2.13 SDS-PAGE在胶分析  30-31
  2.3 结果与分析  31-43
    2.3.1 实验中用到的菌株和质粒  31-32
    2.3.2 最适酶量与最适底物浓度的确定  32-33
    2.3.3 染色前标签对酶活力的影响  33-34
      2.3.3.1 NADH标准曲线的制作  33
      2.3.3.2 双倒数作图法求取K_m和V_m  33-34
    2.3.4 染色后对酶活力的影响  34-36
    2.3.5 染料与标签结合稳定性分析  36-37
      2.3.5.1 高场强对染料与标签结合稳定性的影响  36
      2.3.5.2 加热对染料与标签结合稳定性的影响  36
      2.3.5.3 超声处理对染料与标签结合稳定性的影响  36
      2.3.5.4 微波对染料与标签结合稳定性的影响  36
      2.3.5.5 高压对染料与标签结合稳定性的影响  36-37
    2.3.6 定量分析  37-42
      2.3.6.1 SDS-PAGE分析  37-39
      2.3.6.2 CZE分析  39-40
      2.3.6.3 SPF分析  40-42
    2.3.7 活细胞显影  42-43
    2.3.8 体内染色后的CZE分析  43
  2.4 讨论  43-47
    2.4.1 TC标签与EGFP标签的比较分析  43-45
    2.4.2 CZE分析的条件优化  45
    2.4.3 染料与TC标签结合稳定性分析  45-46
    2.4.4 TC与HPLC连用开拓了应用新领域  46-47
第三章 E.coli超量表达holo-ACP的定量分析  47-58
  3.1 前言  47
  3.2 材料与方法  47-50
    3.2.1 主要仪器与试剂  47
    3.2.2 培养基配方  47
    3.2.3 分子克隆方法  47-48
    3.2.4 载体构建  48-49
      3.2.4.1 pB-lu-ACP构建过程  48
      3.2.4.2 pET-AcpS构建过程  48
      3.2.4.3 pB-lu-ACP-AcpS构建过程  48
      3.2.4.4 pB-lu-his构建过程  48
      3.2.4.5 pB-lu-ACP-his构建过程  48
      3.2.4.6 pGEX-6p-ACP构建过程  48-49
      3.2.4.7 pGEX-6p-ACP-AcpS构建过程  49
    3.2.5 菌种培养与蛋白纯化  49-50
      3.2.5.1 菌种培养  49
      3.2.5.2 DE-23阴离子交换树脂纯化  49-50
      3.2.5.3 AasS的镍柱纯化  50
      3.2.5.4 蛋白含量测定  50
      3.2.5.5 Native-PAGE分析  50
    3.2.6 体外延伸反应  50
    3.2.7 体外染色  50
    3.2.8 体内染色  50
    3.2.9 ACP的MEKC分析  50
  3.3 结果与分析  50-56
    3.3.1 实验中用到的菌株  50-51
    3.3.2 诱导表达后的Native-PAGE分析  51-52
    3.3.3 体外染色后的Native-PAGE分析  52-53
    3.3.4 体外反应后的Native-PAGE分析  53-54
    3.3.5 体内染色后的共聚焦显微镜检测  54-55
    3.3.6 体外染色后的MEKC分析  55-56
  3.4 讨论  56-58
    3.4.1 TC标签对蛋白纯化带来的困难  56
    3.4.2 TC标记的背景来源分析以及应对策略  56-58
第四章结论与展望  58-60
  4.1 结论  58-59
  4.2 展望  59-60
参考文献  60-71
致谢  71-72
附录  72
附图1:载体pB-lu-fabI的构建过程图  72
附图2:载体pET-Nt-fabI的构建过程图  72-73
附图3:载体pET-Wt-fabI的构建过程图  73-74
附图4:载体pET-Ct-fabI的构建过程图  74-75
附图5:载体pET-Bt-fabI的构建过程图  75
附图6:载体pET-Gt-fabI的构建过程图  75-76
附图7:载体pB-lu-ACP的构建过程图  76
附图8:载体pET-AcpS的构建过程图  76-77
附图9:载体pB-lu-ACP-AcpS的构建过程图  77-78
附图10:载体pB-lu-his的构建过程图  78-79
附图11:载体pB-lu-ACP-his的构建过程图  79
附图12:载体pGEX-6p-ACP的构建过程图  79-80
附图13:载体pGEX-6p-ACP-AcpS的构建过程图  80

双砷染料—四半胱氨酸系统在蛋白质标记检测以及定量分析方面的应用

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