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彩绒革盖菌发酵优化制备草酸脱羧酶

作　者: 宫搏阳
导　师: 杨雪霞；洪枫
学　校: 东华大学
专　业: 生物化工
关键词: 草酸脱羧酶彩绒革盖菌发酵产酶诱导方式菊芋汁
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

草酸脱羧酶能催化草酸分解产生甲酸和二氧化碳,主要用于降解造纸废水中的草酸垢、生物检测草酸、临床诊断等方面。目前该酶的低产量限制了酶的推广应用。草酸脱羧酶产量较低的一个重要原因是彩绒革盖菌发酵罐培养生物量较低。为了提高该酶的产量,本文首先从提高彩绒革盖菌发酵罐培养的生物量入手,利用不同类型的搅拌桨降低发酵过程中剪切力对彩绒革盖菌生长的影响,提高菌丝体的生物量,进而提高草酸脱羧酶的产量；在得到较高的菌丝体生物量的基础上,对产酶的诱导方式进行优化,进一步提高菌丝体的产酶量；另外尝试使用菊芋汁作为碳源培养菌丝体产草酸脱羧酶,以降低酶的生产成本和提高酶产量。本课题首先研究比较了六平叶、四斜叶、双螺带、推进式和六箭叶圆盘涡轮搅拌桨等5种搅拌桨类型对彩绒革盖菌生长和产草酸脱羧酶的影响。在200 r/min和120 r/min两种搅拌转速下研究各种搅拌桨对菌丝体生物量的影响,其中四斜叶搅拌桨在两种搅拌转速下菌丝体干重都达到最高,分别为4.1g/L和4.8g/L,分别提高107.6%和123.7%；研究了各种搅拌桨对发酵产酶的影响,采用单次加草酸非恒定pH和以草酸调控恒定pH两种诱导方式诱导产酶,仍然是四斜叶搅拌桨发酵产酶最高,两种诱导方式最高酶活分别为77.9 U/L和199.0 U/L,分别是六平叶圆盘涡轮搅拌桨的5倍和15.8倍。本课题还对彩绒革盖菌产酶的诱导方式进行了优化,主要研究了分批诱导、分批恒定pH诱导、连续诱导和分批连续协同诱导四种方式对诱导菌丝体产酶的影响。通过测定测定发酵产酶过程中的菌丝体干重、蛋白含量、酶活等参数研究各种诱导方式的优劣,其中连续诱导体积酶活和干重比酶活都是最高,分别为386.2 U/L和103.8 U/g；分批连续协同诱导蛋白比酶活最高,达17.7 U/mg。利用菊芋汁培养彩绒革盖菌可以大幅提高菌丝体生物量和草酸脱羧酶产量。本实验以20g/L、40 g/L和80g/L三种糖浓的菊芋汁为碳源,菌丝体干重分别达到6.6g/L、14.1g/L和17.7g/L,总糖转化率(菌丝体干重/初始总糖浓度)分别为33%、35%和22%,分别是葡萄糖培养基的4.1、4.4和2.8倍。此外,还研究了不同浓度的草酸诱导菊芋汁培养基菌丝体产酶的情况,其中20 mM诱导的酶活最高,为63.3 U/L,是葡萄糖培养基的5.1倍。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章引言  11-21
  1.1 草酸  11-12
    1.1.1 草酸的来源及毒性  11
    1.1.2 草酸的降解  11-12
  1.2 草酸脱羧酶  12-19
    1.2.1 来源  13
    1.2.2 性质  13-14
    1.2.3 结构及活性中心  14-15
    1.2.4 催化机理  15-16
    1.2.5 酶活测定方法  16
    1.2.6 分子生物学研究进展  16-17
    1.2.7 草酸脱羧酶的应用  17-19
    1.2.8 草酸脱羧酶的诱导  19
  1.3 本课题研究的目的、主要内容和创新点  19-21
第二章搅拌桨类型对彩绒革盖菌产草酸脱羧酶的影响  21-43
  2.1 实验材料、仪器和方法  21-27
    2.1.1 实验材料与仪器  21-23
    2.1.2 彩绒革盖菌培养基及种子液的制备  23
    2.1.3 彩绒革盖菌的发酵罐培养  23-24
    2.1.4 发酵罐操作  24
    2.1.5 发酵罐培养条件优化  24-25
    2.1.6 粗酶液的提取  25
    2.1.7 草酸脱羧酶活力的测定  25-26
    2.1.8 菌丝体干重测定  26
    2.1.9 蛋白含量的测定  26
    2.1.10 葡萄糖含量的测定  26-27
  2.2 结果与讨论  27-41
    2.2.1 pH值对彩绒革盖菌生长的影响  27-29
    2.2.2 搅拌桨类型对彩绒革盖菌生长的影响  29-32
    2.2.3 诱导后不控pH时搅拌桨类型对彩绒革盖菌产酶的影响  32-37
    2.2.4 诱导后控制pH3.5时搅拌桨类型对彩绒革盖菌产酶的影响  37-41
  2.3 本章小结  41-43
第三章不同诱导方式对彩绒革盖菌产酶的影响  43-61
  3.1 实验材料、仪器和方法  43-46
    3.1.1 实验材料与仪器  43-45
    3.1.2 实验方法  45
    3.1.3 两种诱导pH值对彩绒革盖菌产酶的影响  45
    3.1.4 分批补加草酸对彩绒革盖菌诱导产酶的影响  45
    3.1.5 分批恒定pH诱导彩绒革盖菌产草酸脱羧酶  45
    3.1.6 连续诱导彩绒革盖菌产草酸脱羧酶  45-46
    3.1.7 分批与连续协同诱导彩绒革盖菌产草酸脱羧酶  46
  3.2 结果与讨论  46-59
    3.2.1 两种诱导pH值对彩绒革盖菌产酶的影响  46-48
    3.2.2 分批补加草酸对彩绒革盖菌诱导产酶的影响  48-50
    3.2.3 分批恒定pH诱导对彩绒革盖菌产草酸脱羧酶的影响  50-53
    3.2.4 连续诱导对产草酸脱羧酶的影响  53-56
    3.2.5 分批与连续协同诱导对彩绒革盖菌产草酸脱羧酶的影响  56-59
  3.3 本章小结  59-61
第四章菊芋汁为碳源制备草酸脱羧酶  61-75
  4.1 实验材料、仪器和方法  61-64
    4.1.1 实验材料与仪器  61-63
    4.1.2 实验方法  63
    4.1.3 总糖含量的测定  63
    4.1.4 菊芋汁培养基的制备  63
    4.1.5 菊芋汁培养基培养彩绒革盖菌  63-64
    4.1.6 不同糖浓的菊芋汁培养基培养彩绒革盖菌  64
    4.1.7 菊芋汁培养基产草酸脱羧酶  64
    4.1.8 不同浓度草酸诱导对草酸脱羧酶产量的影响  64
  4.2 结果与讨论  64-74
    4.2.1 菊芋汁培养基对彩绒革盖菌生长的影响  64-66
    4.2.2 不同糖浓的菊芋汁培养基对彩绒革盖菌生长的影响  66-69
    4.2.3 菊芋汁培养基对产草酸脱羧酶的影响  69-71
    4.2.4 不同浓度草酸诱导对产酶的影响  71-74
  4.3 本章小结  74-75
第五章结论  75-78
  5.1 搅拌桨类型对彩绒革盖菌产草酸脱羧酶的影响  75
  5.2 不同诱导方式对彩绒革盖菌产草酸脱羧酶的影响  75-76
  5.3 菊芋汁为碳源制备草酸脱羧酶  76-78
参考文献  78-82
攻读学位期间的研究成果目录  82-83
致谢  83

彩绒革盖菌发酵优化制备草酸脱羧酶

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