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四川蒙顶山苏云金芽胞杆菌cry基因鉴定及其新型模式cry基因的克隆与表达

作　者: 关鹏
导　师: 李平
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 苏云金芽胞杆菌 PCR-RFLP SDS-PAGE cry2Ag1基因克隆和表达杀虫活性
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)作为一种对人畜安全、无环境污染的微生物杀虫剂,在农、林及卫生害虫的防治中发挥了重要的作用,成为国内外开发应用最成功的一种微生物农药。因此深入发掘我国丰富的Bt资源,筛选具有高效广谱杀虫活性的Bt菌株,并对其基因型进行分析,克隆新型杀虫基因,这对微生物杀虫剂的研制、构建高效广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物都具有重要的理论及实践意义。本研究对四川雅安蒙顶山土壤中Bt资源进行了较为系统地调查研究,从中克隆到一个新的cry2型模式基因,并对其进行了初步的表达研究,研究摘要如下：1.根据海拔高度和生态环境的不同,从蒙顶山采集了285份土壤样本,采用醋酸钠-抗生素法对土样中Bt菌株进行分离,获得78株Bt菌株。土样中Bt菌的平均分离率为19%。显微镜观察显示,分离出的Bt菌株产生形态各异的伴胞晶体,有长菱形、短菱形、球形、方形、不定形等,充分显示了蒙顶山生态区Bt资源多样性的特点。利用PCR-RFLP鉴定体系鉴定了78株Bt菌的杀虫晶体蛋白基因类型：其中68株含有cry1型基因,28株含有cry2型基因,2株含有cry3型基因,2株含有cry9型基因,3株含有cry4/10型基因,3株含有cry30型基因。用SDS-PAGE对这些菌株的杀虫晶体蛋白进行分析,结果表明：这些菌株主要表达4种大小的晶体蛋白,分子量在40-130kDa之间。对于没有扩增产物的Bt菌株,其SDS-PAGE分析却检测到晶体蛋白,由此可推测,这些菌株中可能含有新型的杀虫基因。2.用cry2型基因的通用引物鉴定出28株含有cry2型基因的Bt菌株,再用DdeI内切酶分别对它们的扩增产物进行基因分型,结果发现,菌株JF19-2的扩增片段的酶切产物大小与已知的cry2型基因的酶切片段大小存在差异,说明JF19-2中可能含有一个新的cry2型模式基因。3.根据cry2型基因的通用引物对菌株JF19-2的扩增序列,在序列的上游和下游分别设计特异引物SP1和SP2,采用Tail-PCR技术获得两侧的未知序列,将扩增序列克隆并测序,测序结果与已知序列进行拼接,得到了3,285 bp的核苷酸序列,其中含有一个长1,905bp的开放阅读框(ORF),编码一个由635个氨基酸组成的蛋白,分子量为70.8kDa,等电点为9.18,该蛋白为弱碱性蛋白,其中异亮氨酸(Ile)、天冬酰氨(Asn)、色氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)四种氨基酸含量最高,分别为11.2%、10.57%、9.94%和8.36%。氨基酸同源性比较发现,其与Cry2Ab1蛋白同源性最高,为92%。该新基因已在GenBank中注册,其Accession number为ACH91610,被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry2Ag1。4.根据cry2Ag1基因ORF两端序列,设计一对特异引物P1和P2。PCR扩增获得cry2Ag1完整ORF。将获得的片段经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切,与构建的大肠杆菌表达载体pET-22b (+)连接,构建了重组表达质粒pET-2Ag1。将该质粒导入E. coli BL21 (DE3) pLysS,经IPTG诱导能正常表达,SDS-PAGE分析表明：cry2Ag1基因在大肠杆菌中表达一个约60kDa的蛋白,比该基因推导的Cry2Ag1蛋白理论分子量小(70kDa)。生物活性测定表明表达的包涵体蛋白对鳞翅目的小菜蛾和棉铃虫,双翅目的伊蚊均具有杀虫活性,LC50分别为23.47μg/mL、9.74μg/mL、2.54μg/mL。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章文献综述  11-31
  1 Bt资源研究现状  11
  2 Bt的生物学特征及分布  11-12
  3 Bt杀虫晶体蛋白基因  12-23
    3.1 杀虫晶体蛋白基因分类  12-20
    3.2 杀虫晶体蛋白基因的分布  20
    3.3 杀虫晶体蛋白基因的鉴定  20-23
  4 Bt杀虫晶体蛋白  23-28
    4.1 杀虫晶体蛋白三维结构  23-25
    4.2 杀虫晶体蛋白的作用机制  25-28
      4.2.1 晶体蛋白的溶解  26
      4.2.2 酶解活化  26
      4.2.3 毒素与受体结合  26-28
      4.2.4 插入及孔洞或离子通道的形成  28
  5 Bt杀虫晶体蛋白基因的应用  28-29
    5.1 植物抗虫基因工程  28-29
    5.2 重组Bt工程菌的构建  29
      5.2.1 高效广谱Bt工程菌  29
      5.2.2 多功能Bt工程菌  29
  6 本研究的立题依据和目的意义  29-31
第二章蒙顶山Bt的分离和cry基因的鉴定  31-45
  1 材料与方法  31-39
    1.1 材料与仪器  31-34
      1.1.1 土样  31
      1.1.2 培养基  31
      1.1.3 主要试剂  31-32
      1.1.4 仪器设备  32-34
    1.2 研究方法  34-39
      1.2.1 土样的采集方法  34-36
      1.2.2 Bt菌株的分离  36-37
      1.2.3 菌株的保存  37
      1.2.4 Bt总DNA提取  37
      1.2.5 Bt质粒DNA的提取  37-38
      1.2.6 PCR反应  38
      1.2.7 酶切分析  38
      1.2.8 琼脂糖凝胶电泳  38
      1.2.9 DNA回收  38-39
      1.2.10 SDS-PAGE电泳  39
  2 结果与分析  39-44
    2.1 菌株的分离  39
    2.2 伴胞晶体的形态观察  39
    2.3 cry基因的鉴定  39-43
      2.3.1 cry基因的通用引物鉴定结果  39-40
      2.3.2 cry1型基因的酶切鉴定分析  40
      2.3.3 cry2型新基因的发现  40-43
    2.4 Bt杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE分析  43-44
  3 讨论  44-45
第三章 JF19-2中新型模式基因cry2Ag1的克隆表达研究  45-57
  1. 材料与方法  45-49
    1.1 材料与仪器  45-47
      1.1.1 菌株与质粒  45
      1.1.2 培养基  45-46
      1.1.3 主要试剂  46-47
      1.1.4 仪器设备  47
    1.2 研究方法  47-49
      1.2.1 分子生物学操作  47
      1.2.2 阳性克隆的筛选  47
      1.2.3 E. coli质粒DNA提取  47-48
      1.2.4 cry2型新基因部分片段的克隆  48
      1.2.5 序列分析  48
      1.2.6 全长基因的克隆  48
      1.2.7 基因原核表达载体的构建  48-49
      1.2.8 cry2Ag1基因在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE检测  49
  2. 结果与分析  49-55
    2.1 新型模式基因部分序列的克隆测序  49-50
    2.2 新型模式基因全长基因的克隆  50-51
    2.3 Cry2Ag1蛋白氨基酸组成与分析  51-52
    2.4 cry2Ag1基因原核表达载体的构建  52
    2.5 cry2Ag1基因在大肠杆菌中的表达  52-53
    2.6 cry2Ag1基因表达产物的生物活性  53-55
  3. 讨论  55-57
参考文献  57-64
致谢  64

四川蒙顶山苏云金芽胞杆菌cry基因鉴定及其新型模式cry基因的克隆与表达

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