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小麦遗传转化体系建立和优化及抗坏血酸过氧化物酶基因（Ta-APX）转化小麦研究

作　者: 李明浩
导　师: 王秀娥
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种学
关键词: 普通小麦再生体系农杆菌介导基因枪转化 Ta-APX基因
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 12次
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内容摘要

为了建立和优化Alondra’s的高效再生及遗传转化体系,为小麦遗传转化提供更多的受体基因型。本研究以Alondra’s的幼胚为外植体,研究了培养基种类、不同激素等对其幼胚愈伤组织的诱导及其再生的影响。结果表明,在使用N6培养基时,添加3 mg.L-1的2,4-D并附加1000 mg.L-1的CH对其愈伤的诱导效果较好；添加4 mg.L-1的ZT、不附加IAA对其分化效果最好。通过构建植物表达载体pCAMBIA1301-220.6,利用基因枪法将Hyg基因导入到Alondra’s幼胚愈伤组织,以探索Alondra’s的高效遗传转化体系。最终在含100 mg.L-1潮霉素选择培养基上筛选、分化,获得了30株抗性植株,经PCR检测,其中5株为阳性转基因植株,转化率为0.5%。Alondra’s遗传转化体系的建立丰富了小麦遗传转化的基因型,为小麦品种的转基因改良和在不同背景中研究基因的功能奠定了良好的基础。农杆菌介导遗传转化具有外源基因表达稳定、一般为单拷贝等优点,遗传转化效率低、体系不稳定限制了该转化方法在小麦中的广泛应用。为了优化农杆菌介导的小麦遗传转化条件,本研究以普通小麦品种扬麦15和Alondra’s的幼胚产生的愈伤组织为受体材料,通过检测Gus基因的瞬时表达情况,比较了农杆菌介导的主要影响因子的转化效率。结果表明,在相同条件下两个品种农杆菌侵染的最佳条件不尽相同。扬麦15的最佳优化条件为：先在不添加AS的培养基中预培养,然后在菌液浓度为OD600=1.0、AS浓度为100μmol/L条件下侵染10min,最后在25℃共培养Id; Alondra’s则在菌液浓度为OD600=0.5、共培养时间为2d时,表现出最佳的Gus基因瞬时表达率。植物在逆境胁迫及病原菌侵染下,体内活性氧会大量积累,从而破坏正常新陈代谢时清除平衡,活性氧的清除系统对于维持植物的正常生理功能及正常的新陈代谢具有重要的意义。因此,通过植物基因工程的方法,将能够清除植物体内活性氧类物质的过氧化物酶基因导入到综合性状优良的小麦品种中,对于提高小麦的抗氧化胁迫能力有着重要的意义。本实验室在扬麦5号及与其回交7代的小麦/簇毛麦6VS/6AL易位系为材料建立的白粉菌诱导的叶片SSH文库中,克隆了一个小麦抗坏血酸过氧化物酶基因(Ta-APX),并发现该基因在白粉菌侵染初期发挥一定作用。为了进一步研究该基因在抗白粉病中的功能及其作用机制,研究其抗氧化能力与白粉菌侵染应答的关系。本研究在构建植物表达载体pAHC-Ta-APX的基础上,利用基因枪法将其导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织。在含除草剂的培养基上经过筛选和分化,最终获得38株抗性再生植株。根据bar基因、ubi启动子及目的基因序列设计引物,对38株再生植株进行PCR鉴定,最终共获得10株含目的基因的阳性植株。为了研究转基因植株的抗氧化胁迫性,分析了PEG6000诱导及白粉菌胁迫下T1代转基因植株内APX酶活性,结果表明,在两种胁迫诱导下转基因株系的APX酶活性均高于对照植株。在大田条件下对T1代转基因植株进行抗白粉病和赤霉病接种鉴定,结果表明,转基因植株的白粉病和赤霉病抗性均有不同程度的提高,推测转基因植株通过过量表达Ta-APX基因提高了其抗氧化胁迫性,进而提高了对植物病原菌侵染的抵御能力。对转基因T1代植株的主要农艺性状调查结果表明,除株高外转基因植株的其它主要农艺性状与对照相比差异不显著。

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摘要 7-9Abstract 9-12第一部分文献综述 12-30 第一章小麦转基因技术研究进展 12-23 1 小麦转基因技术研究概况 12-13 2 小麦遗传转化的主要方法 13-19 2.1 基因枪法 14-15 2.2 农杆菌介导法 15-17 2.3 其他转化方法 17-19 3 小麦组织培养及其遗传转化研究 19-21 3.1 受体系统的选择 19-20 3.2 培养条件 20-21 4 小麦遗传转化存在的主要问题 21 5 本研究的目的及意义 21-23 第二章抗坏血酸过氧化物酶基因APX及植物抗氧化胁迫基因工程研究进展 23-30 1 植物活性氧产生及其清除系统 23-26 1.1 活性氧产生的途径 23-24 1.2 活性氧的酶促清除系统 24-26 2 植物抗坏血酸过氧化物酶及其在活性氧清除中的作用 26-27 3 植物抗氧化胁迫基因工程研究进展 27-28 4 本研究的目的及主要技术路线 28-30 4.1 研究目的意义 28-29 4.2 技术路线 29-30第二部分研究报告 30-64 第一章普通小麦品种Alondra's遗传转化体系的建立 30-38 1 材料与方法 31-33 1.1 试验材料 31 1.2 试验设计 31-32 1.3 试验方法 32-33 1.4 数据处理 33 2 结果与分析 33-36 2.1 不同处理对Alondra's愈伤组织诱导的影响 33-34 2.2 不同处理对Alondra's分化再生的影响 34-35 2.3 Alondra's的遗传转化和转基因植株的鉴定 35-36 3 讨论 36-38 第二章农杆菌介导的小麦遗传转化条件优化研究 38-44 1 材料与方法 38-40 1.1 供试材料及菌株 38 1.2 小麦幼胚愈伤培养 38-39 1.3 农杆菌的活化及悬浮液的制备 39 1.4 农杆菌介导的遗传转化 39-40 1.5 Gus组织化学染色及数据分析 40 2 结果与分析 40-42 2.1 预培养对小麦愈伤组织Gus基因瞬时表达频率的影响 40 2.2 菌液浓度及侵染时间对小麦愈伤组织Gus基因瞬时表达频率的影响 40-41 2.3 乙酰丁香酮(AS)浓度小麦愈伤组织Gus基因瞬时表达频率的影响 41-42 2.4 共培养时间小麦愈伤组织Gus基因瞬时表达频率的影响 42 3 讨论 42-44 第三章小麦Ta-APX基因的遗传转化及其功能的初步研究 44-64 1 材料与方法 45-54 1.1 试验材料 45-46 1.2 试验方法 46-54 2 结果与分析 54-64 2.1 Ta-APX基因的遗传转化 54-55 2.2 T_0代转基因植株的分子检测 55 2.3 T_1代转基因植株的PCR检测 55-56 2.4 T_1代转基因植株的RT-PCR分析 56-57 2.5 T_1代转基因植株APX酶活性检测 57-58 2.6 T_1代植株苗期白粉病抗性鉴定 58-59 2.7 T_1代转基因植株的赤霉病抗性鉴定 59-61 2.8 转基因植株主要农艺性状分析 61-64全文结论 64-68参考文献 68-80发表文章 80-82致谢 82

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