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甘菊高效再生体系的建立及用TPS1基因进行遗传转化的研究

作　者: 刘占磊
导　师: 吴忠义
学　校: 首都师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 甘菊再生体系筛选压遗传转化 TPS1基因转基因甘菊
分类号: S682.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

菊花（Chrysanthemum grandiflorum）是我国的传统名花和四大切花之一。本研究以甘菊（Chrysanthemum lavandulifolium）为试验材料,用农杆菌侵染法将酵母中的TPS1基因导入甘菊体内,以提高甘菊的抗逆性（抗旱、耐寒和耐盐）。以甘菊无菌苗叶盘为外植体材料,研究了不同NAA和6-BA浓度配比对甘菊叶盘再生的影响,建立了甘菊叶盘的高效再生体系。试验结果表明,甘菊叶盘在MS+NAA（0.1mg/L）+6-BA（0.1 mg/L）培养基上的芽诱导率为98%,繁殖系数为5.4。再生的不定芽在1/2MS+NAA（0.1 mg/L）培养基上经过7天左右可以诱导出根,生根率可达100%。该再生体系完全可以用于甘菊遗传转化的试验。实验进一步研究了甘菊叶盘再生时对卡那霉素（Km）和草丁膦（PPT）的敏感程度,实验结果表明:大于10 mg/L的卡那霉素和大于1.0mg/L的草丁膦能完全抑制甘菊叶盘不定芽的分化。本实验初步确定了8 mg/L卡那霉素和0.8 mg/L草丁膦为甘菊转化适宜的筛选浓度。在建立了甘菊的再生体系的基础上,利用农杆菌介导的遗传转化法进行遗传转化研究。考虑到叶盘预培养时间、农杆菌菌液OD₆₀₀值、侵染时间和共培养时间对菊花的遗传转化的影响,本试验采用叶盘预培养2天、OD₆₀₀=0.6、侵染10分钟和共培养2天的试验条件。共培养后把叶盘转入MS+NAA（0.1 mg/L）+6-BA（0.1mg/L）+Km（8 mg/L）+Cef（250 mg/L）的培养基上进行分化筛选培养,15天后把叶盘转移到MS+NAA（0.1mg/L）+6-BA（0.1 mgm）+Kin（8 mg/L）培养基上,培养40天后侵染的叶盘上分化出不定芽,等不定芽长到2 cm时将其转到1/2MS+NAA（0.1 mg/L）的培养基上进行生根。经抗性筛选得到的再生苗通过PCR扩增表明,侵染后的再生植株中有4棵可以检测出有目的基因TPS1基因的存在,初步确定目的基因已经插入到菊花的基因组中。并初步观察到转化植株表型变化,包括生长迟缓、叶片变小、植株瘦弱等现象。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章文献综述  11-27
  1.引言  11-12
  2.研究进展  12-27
    2.1 菊花的育种目标  12-14
      2.1.1 花期育种  12-13
      2.1.2 花色育种  13
      2.1.3 花型育种  13-14
      2.1.4 株形育种  14
    2.2 菊花传统育种及品种改良  14-17
      2.2.1 杂交育种  14-15
      2.2.2 芽变选种  15-16
      2.2.3 辐射育种  16
      2.2.4 组织培养育种  16-17
      2.2.5 航天育种  17
    2.3 转基因育种  17-19
      2.3.1 改变花色的转基因  17-18
      2.3.2 改变株型和花型的转基因  18
      2.3.3 改变花期的转基因  18
      2.3.4 提高抗性的转基因  18-19
    2.4 菊花转基因的方法研究进展  19-22
      2.4.1 农杆菌介导转化法  19-20
      2.4.2 基因枪法  20
      2.4.3 电击法  20-21
      2.4.4 花粉管通道法  21
      2.4.5 PEG介导转化法  21
      2.4.6 其他转化法  21-22
    2.5 海藻糖基因工程的研究进展  22-27
      2.5.1 海藻糖的应用  22-23
        2.5.1.1 海藻糖在食品行业的应用  22-23
        2.5.1.2 海藻糖在医药行业的应用  23
        2.5.1.3 海藻糖在化妆品方面的应用  23
        2.5.1.4 海藻糖在生物制剂保存方面的应用  23
        2.5.1.5 海藻糖在农业上的应用  23
      2.5.2 海藻糖合酶基因的研究进展  23-24
      2.5.3 海藻糖合酶基因在植物转基因方面的应用  24-27
第二章甘菊遗传转化再生体系的建立  27-37
  1 材料与方法  27-31
    1.1 植物材料  27
    1.2 培养基  27-29
    1.3 数据统计方法  29
    1.4 一般溶液的配制  29
    1.5 方法  29-31
      1.5.1 甘菊无菌苗的获得  29
      1.5.2 培养条件  29-30
      1.5.3 甘菊叶盘再生体系的建立  30
      1.5.4 甘菊叶盘再生Km和PPT筛选压力的确定  30-31
  2.结果与分析  31-36
    2.1 甘菊无菌苗的制备  31
    2.2 甘菊叶盘再生体系的建立  31-34
    2.3 甘菊卡那霉素筛选压的确定  34-35
    2.4 甘菊草丁膦筛选压的确定  35-36
  3.结果与讨论  36-37
第三章植物表达载体的构建及用农杆菌侵染甘菊的研究  37-59
  1.材料和方法  37-44
    1.1 材料  37-39
      1.1.1 菌种及载体  37
      1.1.2 主要分子生物学试剂  37
      1.1.3 主要仪器  37-38
      1.1.4 常用溶液的配制  38-39
    1.2 方法  39-44
      1.2.1 目的基因的获得  39-40
      1.2.2 PCR产物的电泳回收(按天根公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行)  40-41
      1.2.3 PCR扩增产物与pGEM-T载体的连接  41
      1.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备  41-42
      1.2.5 pGEM-T载体连接产物的转化  42
      1.2.6 利用菌液PCR初步验证片段和载体是否连接  42
      1.2.7 质粒DNA的提取  42-43
      1.2.8 质粒DNA的酶切验证  43
      1.2.9 DNA测序及用甘油保存菌  43-44
  2.载体的构建  44-49
    2.1 中间载体的构建  44-45
    2.2 pBI121—TPS1载体的构建  45
    2.3 最终表达载体pBI121-TPS1-bar的构建  45-47
    2.4 最终植物表达载体pBI121-TPS1-bar转化导入农杆菌  47-49
      2.4.1 农杆菌LBA4404感受态的制备  47-48
      2.4.2 农杆菌电击转化  48-49
  3 农杆菌介导表达载体侵染甘菊及再生苗的鉴定  49-50
    3.1 农杆菌介导表达载体浸染甘菊叶盘  49-50
      3.1.1 植物受体材料的预培养  49
      3.1.2 农杆菌的活化  49
      3.1.3 农杆菌侵染  49
      3.1.4 共培养  49
      3.1.5 分化筛选  49
      3.1.6 植株再生  49-50
  4.再生苗的检测  50-51
    4.1 甘菊全基因组DNA的提取(CTAB法提取甘菊基因组总DNA)  50
    4.2 甘菊侵染后再生苗的PCR检测  50-51
  5.结果与分析  51-59
    5.1 目的基因的PCR结果  51-52
    5.2 中间表达载体的构建  52
    5.3 pBI121--TPS1载体的构建结果  52-54
    5.4 最终表达载体的构建  54-55
    5.5 载体导入农杆菌的验证  55-56
    5.6 农杆菌侵染后甘菊叶盘的再生情况  56
    5.7 甘菊总DNA的提取结果  56-57
    5.8 甘菊总DNA的PCR验证  57
    5.9 转化苗的表型观察  57-59
全文结论与展望  59-60
  1.结论  59
  2 展望  59-60
参考文献  60-67
致谢  67

甘菊高效再生体系的建立及用TPS1基因进行遗传转化的研究

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