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农杆菌介导转Bt基因海岛棉技术体系的建立及抗虫性鉴定

作　者: 周丽容
导　师: 曲延英；陈全家
学　校: 新疆农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 陆地棉 海岛棉 再生体系差异 Bt 遗传转化
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究通过对陆地棉和海岛棉下胚轴体细胞胚胎发生差异研究,探讨陆地棉和海岛棉组织培养过程中的差异,并且以新海30和新海16胚性愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法进行Bt基因的遗传转化,通过T1代PCR及T2代RT-PCR检测证实外源基因已整合到了海岛棉基因组中,获得转基因植株,对得到转基因株系进行初步的抗虫性检测,虫饲喂结果初步证实转基因植株具有抗虫性。本研究取得的主要成果如下1.以海岛棉和陆地棉无菌苗下胚轴为外植体,在采用相同的愈伤组织诱导和愈伤组织增殖基本培养基下,筛选海岛棉和陆地棉胚性愈伤组织分化的最佳条件,陆地棉胚性愈伤最适分化条件为：MSB添加1.9g/L KNO3,胚性愈伤组织分化率达到70%以上；海岛棉胚性愈伤组织分化条件：MSB添加1.9g/L KNO3,和0.3mg\LNAA；胚性愈伤组织分化率达到60%以上。陆地棉胚性愈伤组织增殖培养基为：MSB中添加1.9g/L KN03并添加2.0g/L凝固剂gelrite、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺；海岛棉胚性愈伤组织增殖培养基为：MSB中添加3.8g/L KN03并添加2.0g/L凝固剂gelrite、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺。2.海岛棉体细胞形态建成培养基：MSB中KN03加倍并添加2.0g/L凝固剂gelrite、0.1g/L天冬酰胺、0.1g/L谷氨酰胺及0.05mg/L IBA。3.农杆菌介导海岛棉新海30和新海16的胚性愈伤组织,获得转Bt基因的转基因植株。转化条件为：海岛棉胚性愈伤组织于OD值为0.5-0.6的菌液中浸染15min后共培养24h。处理完毕后,将胚性愈伤组织转入添加50mg/L卡那霉素及400mg/L头孢霉素的培养基中,诱导转基因体细胞胚胎分化。抗性子叶胚最佳成苗培养基1/2MSB添加300mg/L头孢霉素和gelrite 2g/L。4.获得的T1代转基因植株进行卡那霉素初步检测,检测结果显示卡那霉素抗性率为12.6%。将卡检阳性的植株进行PCR检测初步筛选转基因植株,并对T1代转基因植株进行抗虫性初步测定,结果显示转基因海岛棉具有一定的抗虫性。将获得的T1代转基因海岛棉经组织培养后获得T2代组培苗,并对T2代转基因植株进行RT-PCR检测,结果显示Bt基因在T2代转基因植株中能够正常传递。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-8
第1章 引言  8-19
  1.1 棉花组织培养研究现状  8-12
    1.1.1 棉花体细胞胚发生研究进展  8-9
    1.1.2 花药培养  9-10
    1.1.3 茎芽培养  10-11
    1.1.4 胚珠和胚培养  11
    1.1.5 原生质体培养  11-12
  1.2 棉花转基因研究现状  12-16
    1.2.1 棉花转基因方法  12-14
    1.2.2 国内外转基因研究进展  14-15
    1.2.3 转基因抗虫棉研究进展  15-16
  1.3 转基因植物常用检测与鉴定  16-18
    1.3.1 基于蛋白质的检测方法  16-17
    1.3.2 基于核酸的检测方法  17-18
  1.4 研究目的和意义  18-19
第2章 陆地棉和海岛棉再生条件差异研究  19-30
  2.1 材料和方法  19-21
    2.1.1 实验材料  19
    2.1.2 种子处理及发芽  19-20
    2.1.3 棉花愈伤组织的诱导  20
    2.1.4 棉花愈伤组织的增殖  20
    2.1.5 陆地棉和海岛棉愈伤组织分化  20
    2.1.6 硝酸盐浓度对陆地棉和海岛棉胚性愈伤组织增殖的影响  20-21
    2.1.7 硝酸盐浓度海岛棉体细胞分化的影响  21
    2.1.8 激素对海岛棉体细胞分化的影响  21
  2.2 结果与分析  21-27
    2.2.1 棉花愈伤组织的诱导  21-22
    2.2.2 棉花愈伤组织的增殖  22
    2.2.3 棉花愈伤组织的分化  22-24
    2.2.4 硝酸盐浓度对棉花胚性愈伤组织增殖的影响  24-25
    2.2.5 硝酸盐浓度对海岛棉体细胞胚胎分化的影响  25-26
    2.2.6 激素对海岛棉体细胞胚胎分化的影响  26-27
  2.3 讨论  27-30
    2.3.1 海岛棉和陆地棉愈伤组织诱导率和诱导状态差异  27
    2.3.2 陆地棉和海岛棉愈伤组织分化条件差异  27
    2.3.3 陆地棉和海岛棉胚性愈伤组织增殖条件的差异  27-28
    2.3.4 棉花体细胞分化  28-30
第3章 农杆菌介导棉花胚性愈伤组织遗传转化的研究  30-39
  3.1 材料与方法  30-32
    3.1.1 植物材料与载体  30
    3.1.2 培养基  30-31
    3.1.3 农杆菌介导棉花胚性愈伤组织遗传转化体系的建立  31-32
    3.1.4 影响棉花胚性愈伤转化影响因子研究  32
  3.2 结果分析  32-36
    3.2.1 浸染时间对农杆菌介导的影响  33
    3.2.2 共培养时间对产生抗性愈伤率的影响  33-34
    3.2.3 抗性胚状体成苗条件的优化  34-36
  3.3 讨论  36-39
第4章 转Bt基因海岛棉的抗虫性功能验证  39-50
  4.1 材料和方法  39-44
    4.1.1 试剂和溶液  39-41
    4.1.2 转基因棉花卡那检测  41
    4.1.3 转基因棉花PCR检测  41-42
    4.1.4 转基因抗虫棉抗虫性测定  42-43
    4.1.5 转基因棉花R-TPCR检测  43-44
  4.2 结果与分析  44-48
    4.2.1 T_1代卡那霉素检测结果分析  44-46
    4.2.2 转Bt基因海岛棉植株PCR检测  46-47
    4.2.3 转抗虫基因棉花的抗虫性测定  47
    4.2.4 RT-PCR检测转Bt基因T_2代植株  47-48
  4.3 讨论  48-50
第5章 结论  50-52
参考文献  52-58
致谢  58-59
作者简历  59

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 > 棉
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