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杨树优良无性系再生体系的建立及转Bt基因的研究

作　者: 程明珠
导　师: 项艳
学　校: 安徽农业大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 杨树 再生体系 Bt基因 遗传转化
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


杨树是我国重要的造林树种,具有适应性强、速生、丰产等特性,是我国主要的短周期工业用材林树种,在生态环境治理和解决木材短缺等方面占有重要地位。虫害是杨树造林生产上面临的一大难题。培育转基因抗虫杨树是近年来兴起的一种新的害虫防治技术,苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一类非常重要的昆虫病原体,它能产生特异性的杀虫晶体蛋白,对农业和林业上的许多害虫具有毒杀作用,是世界范围内广泛使用的抗虫基因。本研究以中涡1号杨树(Populus deltoides cv. Zhongwo1)叶片为外植体,较系统地研究了该杨树品种组织培养再生体系的建立过程。同时构建了含Bt基因的表达载体pBI121+Bt,以南林95杨(Populus×euramericana cv. Nanlin 95)叶片为材料,开展了农杆菌介导下的杨树遗传转化,并对转化植株进行了抗性筛选和PCR检测,获得了如下主要结果:1、以中涡1号杨树叶片为外植体建立其再生体系,最佳的消毒时间为使用75 %的酒精消毒15 s,0.1 % HgCl2消毒4 min,叶片的污染率为15 %,出愈率达到82 %。2、中涡1号杨树叶片适宜的诱导愈伤培养基为MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 1.0 mg/L;适宜的分化培养基为MS + KT 0.1 mg/L + NAA 0.1 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L +蔗糖25 g/L;生根的最佳培养基为1/2MS + IBA 0.6 mg/L。3、进行了中涡1号杨树无菌苗叶片直接诱导不定芽的研究,获得叶片分化的最佳培养基配方为MS + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 1.0 mg/L +蔗糖25 g/L。4、通过酶切、纯化、连接、转化等基因工程操作方法构建了含Bt CrylC基因的表达载体pBI121+ Bt,通过冻融法将其直接导入农杆菌EHA105中。5、以南林95杨组培苗叶片为材料,采用根癌农杆菌介导的叶盘法进行遗传转化。经卡那霉素抗性筛选,共获得11株卡那霉素抗性苗,通过PCR检测,初步获得4株转Bt基因植株。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-7
1 文献综述  7-15
  1.1 杨树组织培养的研究进展  7-10
    1.1.1 杨树组织培养的概述  8-9
    1.1.2 杨树组织培养的影响因子  9-10
  1.2 苏云金芽胞杆菌（Bt）及其杀虫晶体蛋白  10-12
    1.2.1 苏云金芽胞杆菌（Bt）概述  10
    1.2.2 Bt 杀虫晶体蛋白及其基因分类  10-11
    1.2.3 Bt 杀虫晶体蛋白的结构与功能  11
    1.2.4 Bt 杀虫晶体蛋白的作用机理  11
    1.2.5 Bt 杀虫晶体蛋白基因的修饰、改造  11-12
    1.2.6 Bt 杀虫晶体蛋白的应用简史  12
  1.3 转Bt 基因杨树的研究进展  12-15
    1.3.1 杨树遗传转化技术  12-13
    1.3.2 转Bt 基因杨树  13-15
2 引言  15-17
  2.1 课题的研究意义  15
  2.2 课题的主要内容  15-16
  2.3 研究采用的技术路线  16-17
3 材料与方法  17-27
  3.1 实验材料  17-18
    3.1.1 植物材料  17
    3.1.2 菌株和质粒  17-18
    3.1.3 Cry1C*基因PCR 反应引物  18
  3.2 主要仪器设备和试剂  18-20
    3.2.1 主要仪器设备  18-19
    3.2.2 主要试剂  19
    3.2.3 有关试剂和培养基的配制  19-20
  3.3 试验方法  20-27
    3.3.1 中涡1 号杨树叶片再生体系的建立  20-21
    3.3.2 Bt 基因表达载体p81121＋Cry1C*的构建  21-24
    3.3.3 p81121+Bt 表达载体转化农杆菌  24-25
    3.3.4 目的基因转化南林95 杨  25-26
    3.3.5 转基因植株的PCR 检测  26-27
4 结果与分析  27-33
  4.1 杨树叶片再生体系的建立  27-30
    4.1.1 不同处理对外植体消毒效果的影响  27
    4.1.2 不同激素浓度对诱导愈伤组织的影响  27-28
    4.1.3 不同培养基对分化的影响  28-30
    4.1.4 不同激素配比对叶片不定芽诱导的影响  30
    4.1.5 不同浓度的IBA 对试管苗生根的影响  30
  4.2 载体构建验证  30-32
    4.2.1 质粒pCAMBIA1300+Cry1C*的酶切鉴定  30-31
    4.2.2 质粒p81121+GUS的酶切鉴定  31
    4.2.3 p81121+Bt表达载体构建验证  31
    4.2.4 表达载体p81121+Bt导入农杆菌的PCR验证  31-32
  4.3 目的基因的转化  32
  4.4 转基因植株PCR 检测  32-33
5 结论与讨论  33-35
  5.1 结论  33
  5.2 讨论  33-35
    5.2.1 杨树叶片再生体系的建立  33-34
    5.2.2 杨树的遗传转化  34-35
参考文献  35-43
附录  43-46
致谢  46-47
作者简介  47
成果清单  47

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中图分类: > 农业科学 > 林业 > 森林树种 > 阔叶乔木 > 杨
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