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HCV重组腺病毒的构建、鉴定及初步免疫学效果观察

作　者: 邬冬云
导　师: 周向军；李进
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物工程
关键词: 丙型肝炎病毒 核心蛋白 重组腺病毒 免疫应答
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,简称HCV)感染是当前危害人类健康的重要传染病之一,目前除干扰素联合利巴韦林外尚无有效预防和治疗手段。因此,寻找其他治疗途径,预防和清除HCV的持续感染很有必要。而将编码HCV抗原的外源基因导入机体诱导产生特异性T细胞免疫反应的HCV新型疫苗目前正在受到人们的重视。以重组复制缺陷型腺病毒(replication-deficient recombinant adenovirus,rAd)为载体的疫苗,能模拟天然病毒有效地将外源基因导入宿主细胞内并使之高效表达,诱导机体产生针对目的抗原的免疫应答。为此,我们利用AdMaxTM腺病毒包装系统构建可表达HCV核心抗原Core的HCV重组腺病毒pAd-Core,并观察其免疫小鼠后,诱导机体产生特异性免疫应答的能力,为进一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治疗奠定基础。方法RT-PCR法从丙型肝炎患者血清中扩增出HCV Core基因,定向克隆到重组腺病毒AdMaxTM系统的穿梭质粒pDC315的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-Core,在脂质体介导下与腺病毒基因组骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染至HEK293细胞,通过同源重组包装产生复制缺陷型重组腺病毒pAd-Core;经HEK293细胞扩增后,离子交换柱层析法纯化病毒,测定病毒颗粒数和滴度;利用重组腺病毒体外感染人肝癌细胞株HepG2,经免疫印迹(Western Blot)方法检测目的蛋白的表达,通过酶联免疫吸附试验(enzyme 1inked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫小鼠血清抗体水平,酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunosorbent spot ,ELISPOT)检测免疫小鼠特异性T淋巴细胞免疫反应。结果重组腺病毒pAd-Core经PCR及序列测定证实Core基因插入正确,在HEK293细胞中具有良好的感染性;扩增纯化后,重组腺病毒的比活性可达3.42IU/100VP,单细胞产量可达2.63×104VP/cell;Western Blot检测结果表明pAd-Core在HepG2细胞可稳定表达目的蛋白,免疫小鼠后可刺激机体产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答.结论成功构建了表达HCV核心抗原Core的HCV重组腺病毒pAd-Core,该重组腺病毒可在人肝癌细胞株HepG2细胞内稳定表达目的蛋白,并且能够诱导机体产生有效的体液免疫应答和细胞免疫应答,具有成为丙肝疫苗的发展潜力。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-12
第一章 绪论  12-24
  1.1 HCV 研究状况  12-18
    1.1.1 HCV 流行与传播  12-13
    1.1.2 HCV 基因组结构及特点  13-15
    1.1.3 HCV 的预防与治疗  15
    1.1.4 机体对 HCV 的免疫应答  15-17
    1.1.5 HCV 疫苗研究  17-18
  1.2 腺病毒载体研究状况  18-23
    1.2.1 腺病毒简介  18-19
    1.2.2 腺病毒载体的优点  19-20
    1.2.3 腺病毒载体的构建策略  20-22
    1.2.4 腺病毒载体的应用  22-23
  1.3 本研究的目的和意义  23-24
第二章 HCV 重组腺病毒的构建、鉴定  24-52
  2.1 仪器与材料  24-28
    2.1.1 质粒、菌株及细胞株  24-25
    2.1.2 主要生化试剂、工具酶及试剂盒  25-26
    2.1.3 仪器设备  26
    2.1.4 主要溶剂配制  26-28
  2.2 实验方法  28-45
    2.2.1 目的基因制备  29-38
    2.2.2 重组腺病毒穿梭质粒的构建  38-42
    2.2.3 重组腺病毒的包装  42-43
    2.2.4 重组腺病毒的鉴定  43-45
  2.3 实验结果  45-51
    2.3.1 RT-PCR获取HCV Core基因片段  45-46
    2.3.2 重组T载体pMD19-C的PCR鉴定  46-47
    2.3.3 重组T 载体pMD19-Core 序列测定  47
    2.3.4 重组穿梭质粒pDC315-Core的鉴定  47-48
    2.3.5 重组腺病毒的包装  48-49
    2.3.6 重组腺病毒感染性鉴定  49
    2.3.7 重组腺病毒质粒DNA的PCR鉴定  49-50
    2.3.8 重组腺病毒质粒DNA序列测定  50-51
  2.4 本章小结  51-52
第三章 HCV 重组腺病毒初步免疫学效果观察  52-75
  3.1 仪器与材料  52-55
    3.1.1 实验动物  52
    3.1.2 细胞株及病毒  52
    3.1.3 生化及化学试剂  52-53
    3.1.4 主要仪器  53
    3.1.5 主要溶剂配制  53-55
  3.2 方法  55-64
    3.2.1 重组腺病毒的扩增、纯化 及病毒颗粒数、滴度测定  55-58
    3.2.2 重组腺病毒体外转染 HepG2 细胞目的蛋白表达测定  58-60
    3.2.3 重组腺病毒初步免疫效果观察  60-64
  3.3 结果  64-68
    3.3.1 重组腺病毒病毒颗粒数、滴度测定及比活性、单细胞产量计算  64-66
    3.3.2 Western Blot 检测目的蛋白表达  66-67
    3.3.3 HCV 重组腺病毒免疫小鼠血清抗-HCV-Core 滴度检测结果  67
    3.3.4 HCV 重组腺病毒免疫小鼠特异性细胞免疫反应检测  67-68
  3.4 本章小结  68
  3.5 综合讨论  68-75
    3.5.1 目的基因的选择  68-69
    3.5.2 载体的选择  69-70
    3.5.3 腺病毒载体的构建及表达  70-72
    3.5.4 腺病毒滴度测定  72-73
    3.5.5 HCV 重组腺病毒初步免疫学效果观察  73-75
全文总结  75-77
参考文献  77-86
附录  86-88
致谢  88-89
攻读硕士期间发表的相关学术论文  89-91

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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