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丙型肝炎病毒基因型及F蛋白与丙型肝炎慢性化、肝癌细胞凋亡的关系研究

作　者: 杨静静
导　师: 张云
学　校: 南京医科大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 丙型肝炎病毒 HCV基因型 F蛋白抗体 HCV持续感染自限清除慢性化双移位F蛋白 HepG2 凋亡肿瘤坏死因子α 流式细胞术 DNA Ladder
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

丙型肝炎病毒(HCV)感染所引起的丙型肝炎呈全球分布。据WHO估计,目前全世界约有1.8亿HCV感染者,且呈增长趋势,特别是在静脉注射吸毒人群(IDUs)中HCV的感染率远远高于一般人群,是重要的传染源。HCV感染所致的丙型肝炎慢性化率高达75%～85%,可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌,对人类的健康和生命构成了严重威胁。HCV感染慢性化是病毒变异与宿主免疫相互作用的结果。HCV基因组呈现较高的变异性,表现为准种(quasi-species)变异和不同地区优势病毒株的基因型不同。变异的主要目的在于逃避宿主的免疫监视,从而能在宿主体内持续存在,形成慢性感染。HCV基因型分布存在地理性差异,我国大部分地区主要流行的HCV型别为基因1b型,其次为基因型2a。在南方城市基因1b型感染率占90%以上。国内外相关研究表明,基因1b型在慢性肝炎、肝硬化和肝癌中占绝大多数,提示基因1b型与HCV感染慢性化有关。丙型肝炎病毒属黄病毒属,全长约9.6kb,为一单股正链RNA,分为5’非翻译区(UTR)、一个开放读码框(ORF)和3’非翻译区,编码一个由3000多个氨基酸组成的复合蛋白前体,在宿主信号肽酶和病毒蛋白酶的作用下裂解产生至少10种基因产物:四种结构蛋白(Core、E1、E2、p7)和六种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。在HCV编码的十几种蛋白中,核心蛋白(Core,简称C)是HCV多聚蛋白前体经细胞信号肽酶剪切而产生的非糖基化蛋白,由191个氨基酸(aa)组成。该蛋白的氨基酸序列十分保守,具有调控多种细胞基因,影响细胞生长、增生及凋亡的能力。近年来外国学者在感染HCV的患者血清中发现了HCV F蛋白,是由HCV C基因编码的另一个产物,它是由C基因密码子核苷酸移位后产生的。其在HCV不同基因型的高度保守性和在患者体内抗体的存在,显示F蛋白在HCV生命周期中起重要作用。2003年Boulant在研究HCV 1b型C基因在E.coli内的表达情况时,发现了双移位F蛋白(ARFP/DF)。DF蛋白以1b型C基因的AUG为启动子,按照C基因阅读框翻译到42位aa时,发生-2/+1框移位,然后按照C+1阅读框翻译,到达第144位aa时再次发生移位,重新按照C基因阅读框翻译,直至终止子。DF是部分F基因与部分C基因的嵌合性产物,是一种F-C蛋白嵌合体,在其产生过程中核糖体发生了两次移位。目前国内外尚无对DF的功能研究。为了研究HCV基因型与F蛋白抗体在江苏吸毒人群HCV患者中分布情况,探讨HCV基因型、F蛋白抗体与HCV感染慢性化的关系以及HCV1b型DF蛋白与肝细胞癌(HCC)之间的关系。我们进行了如下研究:第一部分丙型肝炎病毒基因型及F蛋白抗体与吸毒人群丙型肝炎病毒感染关系的研究目的:研究HCV基因型及F蛋白抗体与吸毒人群HCV感染慢性化之间的关系。方法:本研究对象为南京市强制戒毒所HCV抗体阳性强制戒毒人员360人,根据血样检测HCV RNA及ALT水平分为持续感染组168人(HCV RNA阳性,ALT≥40 U/L)及自限清除组192人(HCV RNA阴性,ALT<40 U/L)。分别应用HCV RNA基因分型检测试剂盒HCV和酶联免疫方法( MUREX HCVSerotyping 1-6 Assay)检测HCV基因型和HCV血清型;将本实验室纯化后的重组表达蛋白HCV-F/GST作为抗原包被酶联反应板,以两组待测血清标本为一抗,辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体为二抗,以GST蛋白孔作为本底对照,ELISA间接法分别检测两组血清。结果:通过比较HCV持续感染者和自限清除者之间的人口学特征、HCV分型和F蛋白抗体分布差异,分析得出:持续感染组和自限清除组之间性别构成差异有统计学意义;持续感染组的基因1型及混合基因型所占百分比比自限清除组稍高,而基因2型却相反。两组间基因分型构成比有显著性差异(P<0.05);持续感染组的HCV-F抗体阳性率比自限清除组略高(36.3% vs 27.6%);采用单因素和多因素logistic回归分析,结果发现男性患者(OR=1.43; 95%CI,1.03-2.49;P=0.032)、感染HCV基因1型(OR=4.18; 95%CI,2.14-8.13; P=0.0001)、HCV-F抗体阳性(OR=1.73;95%CI,1.08-2.47;P=0.047)能够增加HCV感染慢性化的风险。结论:吸毒人群中男性患者、感染HCV基因1型或HCV-F抗体阳性更易导致HCV感染慢性化。由于国内外尚无HCV-F抗体与HCV感染转归的报道,且吸毒人群HCV基因型的感染呈现复杂趋势,开展HCV感染慢性转归影响因素研究,有利于阐明中国人群HCV易感性特点和感染转归的可能机理,对疫苗研制、个体化预防和治疗、控制我国人群HCV感染,具有重要的理论和实践意义。第二部分丙型肝炎病毒基因1b型双移位F蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响目的:HCV基因1b型在慢性肝炎、肝硬化和肝癌中占绝大多数,而国内外尚无HCV 1b型双移位F(DF)蛋白对肝癌细胞凋亡影响的研究报道。本部分主要研究丙型肝炎病毒基因1b型DF蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2凋亡的影响。方法:构建真核表达重组质粒pcDNA3.0-DF-EGFP,并利用Lipofectamine 2000转染人肝细胞癌细胞系HepG2,同时设pcDNA3.0-C-EGFP-HepG2为阳性对照、pcDNA3.0-HepG2为阴性对照及未转染HepG2为空白对照,以Act-D、TNFα诱导四组细胞系发生凋亡,Annexin V-FITC/PI双染检测肿瘤细胞凋亡率,并使用细胞凋亡DNA Ladder检测,进一步验证HCV 1b型DF蛋白在肝细胞凋亡的生物学功能效应。结果:pcDNA3.0-DF-EGFP-HepG2细胞系在发生凋亡的时间上比pcDNA3.0-C-EGFP-HepG2快,但相对阴性对照组及未转染HepG2细胞系有明显延迟,凋亡的发生率也明显低于阴性对照及空白对照细胞系(P<0.001)。结论:由于外源性基因HCV 1b型DF的引入及表达,对HepG2细胞的凋亡有抑制作用。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-12
前言  12-17
第一部分丙型肝炎病毒基因型及 F 蛋白抗体与吸毒人群丙型肝炎病毒感染关系的研究  17-33
  材料  18-19
  方法  19-25
  结果  25-29
  讨论  29-33
第二部分丙型肝炎病毒基因16型双移位F蛋白对人肝细胞癌细胞株HepG2 凋亡的影响  33-55
  材料  34-37
  方法  37-46
  结果  46-52
  讨论  52-55
小结  55-56
参考文献  56-63
文献综述  63-71
  参考文献  67-71
附录一英文缩略表  71-73
附录二发表论文  73-74
致谢  74

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