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结核分枝杆菌MPT83重组腺病毒载体的构建及表达

作　者: 陈水木
导　师: 邓洪平；何秀云
学　校: 西南大学
专　业: 遗传学
关键词: 结核分枝杆菌 MPT83 重组腺病毒载体重组腺病毒
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的慢性传染病,MTB可能侵入人体全身各种器官,但主要侵犯肺,称为肺结核。据世界卫生组织(WHO)统计,全世界每年有1000万新发病例,150万人死于结核病。我国高居全球结核病高负担国家的第二位,现有MTB感染人数已达4亿,传染性TB患者达到200万。卡介苗(BCG)作为目前唯一用于预防结核病的疫苗,对于儿童重症结核病如粟粒型结核和结核性脑膜炎具有预防作用,但是对于预防成年人结核病效果不理想,保护率为0-80%不等。目前,很多国家都在研究结核新疫苗,已有200多种的候选疫苗,其中有的正在进行动物模型实验,有的已经进入临床实验。近几十年,随着耐药MTB增多及HIV共感染等问题,加重了结核病的严重性。所以开发新型有效的结核病疫苗迫在眉睫,希望尽快开发出更安全、高效、低成本、并可广泛用于各类人群的新型结核病疫苗。本文以广泛使用的Ad-Easy腺病毒包装系统为基础,构建结核分枝杆菌MPT83 重组腺病毒疫苗。首先PCR获取结核分枝杆菌MPT83基因,然后再将MPT83基因重组于穿梭载体pAdTrack-CMV;通过化学转化法将线性化的重组穿梭质粒(pAdTrack-CMV-MPT83)和病毒骨架质粒(pAdEasy-1)共转入大肠杆菌BJ5183,重组穿梭质粒和病毒骨架质粒在BJ5183发生同源重组形成重组腺病毒质粒(rAd-GFP-MPT83);线性化的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞,并于HEK293细胞中包装成病毒;mRNA和蛋白水平上检测目的基因的表达;大量扩增腺病毒,体外通过MTT实验初步验证重组腺病毒的免疫原性;体内通过重组腺病毒免疫小鼠,整体荧光成像观察报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在小鼠体内的表达与分布,间接跟踪目的基因在小鼠体内的表达情况。结果表明:(1)成功构建结核分枝杆菌MPT83重组腺病毒载体,构建的重组腺病毒载体于HEK293细胞中成功包装腺病毒。通过RT-PCR和Western-Blotting实验,分别于mRNA和蛋白水平上检测均表明结核分枝杆菌MPT83基因在HEK293细胞中表达。(2)MTT实验表明:vAd-GFP-MPT83病毒液比vAd-GFP病毒液具有更强的刺激体外淋巴细胞增殖的能力,证实了目的蛋白具有很强的刺激淋巴细胞增殖的能力,即其免疫原性。(3)小鼠活体实验表明:vAd-GFP-MPT83病毒免疫小鼠后,报告基因GFP于免疫后第4d达到高峰,一直到半个月之后还有很强的表达,同时表达的范围也由原来注射的部位向周边扩散。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
第1章文献综述  9-18
  1.1 结核病的发病机理  9
  1.2 机体抗结核分枝杆菌感染的机制  9-12
  1.3 结核病疫苗  12-16
  1.4 腺病毒载体构建综述  16-18
第2章引言  18-20
  2.1 研究的背景  18
  2.2 研究的目的与意义  18-20
第3章材料与方法  20-36
  3.1 材料与试剂  20-23
  3.2 方法  23-36
第4章结果与分析  36-44
  4.1 结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA的提取与定量  36
  4.2 重组穿梭质粒的构建与鉴定  36-37
  4.3 重组腺病毒的构建及其鉴定  37-39
  4.4 重组腺病毒质粒转染HEK293细胞  39
  4.5 病毒扩增和滴度测定  39
  4.6 mRNA水平上检测目的基因表达  39-41
  4.7 蛋白水平上检测目的基因表达  41
  4.8 体外淋巴细胞增殖  41-43
  4.9 活体荧光成像  43-44
第5章讨论  44-46
第6章结论与展望  46-47
  6.1 结论  46
  6.2 展望  46-47
参考文献  47-53
附录  53-54
致谢  54-55
发表论文及参加课题  55

结核分枝杆菌MPT83重组腺病毒载体的构建及表达

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