学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

柑橘溃疡病菌环媒恒温基因扩增技术的建立

作　者: 董欢
导　师: 邓欣
学　校: 湖南农业大学
专　业: 生物安全与检疫
关键词: 柑橘溃疡病菌 LAMP 扩增条件 致病性测定 ELISA检测 PCR检测
分类号: S436.66
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 42次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


柑橘溃疡病是全球流行的检疫性植物病害,病原为地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)。该病危害性大、分布范围广、传播速度快、防治难度大,是国内外柑橘种植区防疫的重点。本论文对柑橘溃疡病菌进行了分离培养、致病性测定、PCR检测、ELISA检测并研究建立了柑橘溃疡病菌的环媒恒温基因检测方法。环媒恒温基因扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本学者Notomi于2000年首先提出并建立的一种基因扩增新技术。它的主要原理是依赖以特异性目的基因设计出来的4条特异性明显的引物和一种具有链置换反应的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase large fragment),在等温条件下进行靶序列扩增的一种反应。将采自湖南衡山橘园的感病标本进行分离培养纯化,革兰氏染色鉴定,并对其进行致病性测定,确认为柑橘溃疡病菌。实验以柑橘溃疡病菌为抗原,经过抗原制备、抗体制造、纯化和间接ELISA反应条件优化,建立起对柑橘溃疡病菌的ELISA检测法,在抗原包被浓度为1：400(1.5×105cfu/mL)、抗体稀释浓度为1：800(3.9μg/mL)、5%脱脂牛奶封闭2h后用1：1500的酶标抗体浓度(2.6μg/mL)作用60min,最后在加入底物显色30min可得到最佳实验效果。PCR检测基于王中康早期设计的一对引物对柑橘溃疡病菌进行优化实验,得到优化结果为：95℃预变性4min；然后94℃变性30s,59℃30s,72℃延伸30s,共35个循环。扩增柑橘溃疡病菌产生的特异性片段为413bp。该方法对柑橘样品病斑研磨液的检测结果为阳性,而对照检测稻白叶枯病菌、烟草青枯病菌、马铃薯环腐病菌、大白菜软腐病菌时扩增结果为阴性,表明该方法具有较高的准确性。LAMP检测基于柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因设计筛选出F3、B3、FIP、BIP特异性引物,确立了最佳体系和扩增条件：95℃预变性7min；冰浴8min；64℃孵育90min；80℃下灭活Bst酶3min。建立了一种全新的柑橘溃疡病菌检测技术-环媒恒温基因扩增技术(LAMP)。并以水稻白叶枯病菌、烟草青枯病菌、马铃薯环腐病菌、大白菜软腐病菌4种病菌为阴性对照,对该方法特异性和敏感性进行评估,结果表明,环媒恒温基因扩增技术在柑橘溃疡病菌的检测中具有快速、灵敏度高、特异性好等优势,其最低检测下限为60cfu/mL。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-15
第一章 文献综述  15-29
  1 前言  15-16
  2 病菌的生物学特性  16-18
    2.1 分类地位及菌系分化  16-17
    2.2 病原物特征  17
    2.3 病菌的寄主范围和抗性研究  17-18
    2.4 病原菌致病症状  18
  3 柑橘溃疡病的检测方法  18-23
    3.1 常规检测方法  18-19
      3.1.1 症状识别法  19
      3.1.2 病原菌分离培养及致病性测定法  19
    3.2 噬菌体检验法  19-20
    3.3 血清学检测技术  20-21
      3.3.1 酶联免疫吸附法(ELISA)  20-21
      3.3.2 胶体金免疫层析方法  21
    3.4 分子杂交检测法  21
    3.5 PCR检测方法  21-22
    3.6 DNA指纹图谱分析  22
    3.7 脂肪酸甲脂光谱分析诊断法  22-23
    3.8 激光检测法  23
    3.9 滚环扩增检测技术(Rolling circle amplification,RCA)  23
  4 环媒恒温基因扩增技术(LAMP)及其研究进展  23-27
    4.1 环媒恒温基因扩增技术原理  23-26
      4.1.1 引物设计  23-24
      4.1.2 LAMP技术扩增机制  24-26
    4.2 LAMP技术的特点  26-27
    4.3 LAMP技术研究进展  27
      4.3.1 LAMP技术研究方向  27
      4.3.2 LAMP技术应用领域分布  27
  5 本研究的目的和意义  27-29
第二章 柑橘溃疡病菌的分离培养与致病性鉴定  29-36
  1 材料与方法  29-31
    1.1 材料  29-30
      1.1.1 病菌来源  29
      1.1.2 主要试剂及配制  29-30
      1.1.3 主要仪器  30
      1.1.4 实验材料  30
    1.2 方法  30-31
      1.2.1 病原菌的分离培养  30
      1.2.2 革兰氏染色法  30
      1.2.3 致病性测定  30-31
      1.2.4 柑橘溃疡病菌生长速度的测定  31
  2 结果与分析  31-34
    2.1 形态与染色特性  31-32
    2.2 致病性测定  32-33
    2.3 柑橘溃疡病菌生长速度测定  33-34
  3 讨论与小结  34-36
第三章 ELISA法检测柑橘溃疡病菌  36-45
  1 材料与方法  36-40
    1.1 材料  36-37
      1.1.1 菌种  36
      1.1.2 主要试剂  36-37
      1.1.3 主要设备仪器  37
    1.2 方法  37-38
      1.2.1 抗原的制备  37
      1.2.2 大鼠免疫  37
      1.2.3 抗Xac IgG的收集纯化  37-38
      1.2.4 间接ELISA法操作步骤  38
    1.3 ELISA法检测柑橘溃疡病菌最佳条件的确定  38-39
      1.3.1 抗原最适包被浓度的确定  38
      1.3.2 封闭时间的确定  38-39
      1.3.3 抗体最适浓度的确定  39
      1.3.4 抗体最佳作用时间的确定  39
      1.3.5 酶标抗体最适浓度的确定  39
      1.3.6 酶标抗体最佳作用时间的确定  39
      1.3.7 底物最佳作用时间的确定  39
    1.4 ELISA灵敏度检测  39
    1.5 ELISA特异性检测  39-40
  2 结果与分析  40-43
    2.1 免疫效果  40
    2.2 抗原最适包被浓度的确定  40
    2.3 封闭时间的确定  40-41
    2.4 抗体最佳作用时间的确定  41
    2.5 酶标抗体最适浓度的确定  41-42
    2.6 酶标抗体最佳作用时间的确定  42
    2.7 底物最佳作用时间的确定  42
    2.8 ELISA灵敏度检测  42-43
    2.9 ELISA特异性检测  43
  3 讨论  43-44
  4 结论  44-45
第四章 PCR法检测柑橘溃疡病菌  45-54
  1 材料与方法  45-47
    1.1 材料  45-46
      1.1.1 实验菌株  45
      1.1.2 主要试剂  45
      1.1.3 主要仪器  45-46
      1.1.4 引物合成  46
    1.2 方法  46-47
      1.2.1 细菌DNA模板的制备  46
      1.2.2 PCR反应条件的优化  46
      1.2.3 PCR特异性试验  46
      1.2.4 PCR敏感性试验  46
      1.2.5 PCR实际检测  46-47
  2 结果与分析  47-52
    2.1 PCR条件的确立  47-49
      2.1.1 引物浓度  47
      2.1.2 Taq酶浓度  47-48
      2.1.3 dNTPs浓度  48-49
      2.1.4 退火温度  49
    2.2 标准株检测实验  49-50
    2.3 PCR特异性试验  50-51
    2.4 PCR敏感性试验  51-52
    2.5 PCR实际检测应用  52
  3 讨论与结论  52-54
第五章 柑橘溃疡病菌LAMP法的建立  54-67
  1 材料与方法  54-57
    1.1 材料  54-55
      1.1.1 实验菌株  54
      1.1.2 主要试剂  54-55
      1.1.3 主要仪器  55
    1.2 方法  55-57
      1.2.1 细菌DNA模板的提取  55
      1.2.2 环媒恒温基因扩增技术(LAMP)引物设计  55-56
      1.2.3 LAMP反应  56
      1.2.4 LAMP特异性试验  56
      1.2.5 LAMP灵敏性试验  56
      1.2.6 LAMP实际检测应用  56-57
  2 结果与分析  57-64
    2.1 LAMP检测法的建立和条件的确定  57-60
      2.1.1 MgSO4浓度  57
      2.1.2 dNTPs浓度  57-58
      2.1.3 甜菜碱浓度  58-59
      2.1.4 反应温度  59-60
      2.1.5 反应时间  60
    2.2 LAMP反应体系的确立  60-62
    2.3 LAMP特异性试验  62
    2.4 LAMP灵敏性试验  62-63
    2.5 LAMP实际检测应用  63-64
  3 讨论  64-66
    3.1 柑橘溃疡病菌LAMP法目的基因的选择与引物设计  64
    3.2 模板制备  64-65
    3.2 柑橘溃疡病菌LAMP法的条件优化  65
    3.3 柑橘溃疡病菌LAMP法的特异性和敏感性  65
    3.4 LAMP法检测柑橘溃疡病菌的优点  65-66
    3.5 LAMP法建立的注意事项  66
  4 小结与展望  66
  5 本论文创新点及进一步工作  66-67
参考文献  67-73
附录A 环媒恒温基因扩增技术文献计量参考文献  73-86
附录B 柑橘溃疡病菌AE008923.1基因  86-89
附录C 论文中的重要英文缩写  89-90
致谢  90-93
作者简介  93

相似论文

  1. 禽致病性大肠杆菌鸭源分离株侵袭相关基因致病机理研究,S852.61
  2. 鸡源志贺菌在感染雏鸡体内的动态分布,S858.31
  3. cPL双抗体夹心ELISA检测犬急性胰腺炎方法的建立与应用,S858.292
  4. 金华地区猪圆环病毒病流行学调查,S858.28
  5. 纳米磁珠与PCR联合技术在玉米病原菌快速检测中的应用研究,S435.131
  6. 社会性网络服务研究及应用平台开发,TP393.09
  7. 环介导等温扩增同时检测沙门菌和志贺菌的研究,Q93-3
  8. 猪圆环病毒2型（PCV-2）感染小鼠传播途径的研究,S858.28
  9. 烟台地区规模化肉种鸡场免疫抑制性疫病的流行病学调查,S858.31
  10. 洋葱鳞茎细菌性软腐病病原及农业措施防控技术,S436.33
  11. SacB基因在紫花苜蓿中的转化和植株再生的研究及PCR扩增条件的确立,S541.9
  12. 抗卵清蛋白单克隆抗体的制备及卵清蛋白、醇溶蛋白ELISA检测方法的建立,R155.5
  13. 精品课程网络平台系统的开发,TP311.52
  14. 利玛原甲藻分子生物学检测技术的研究,X830.2
  15. 快速检测鱼类淋巴囊肿病毒和海洋双RNA病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用,S948
  16. 利用基因工程创造香樟抗寒树种新种质技术研究,S792.23
  17. 石河子地区加工番茄病毒种类的ELISA检测及分子鉴定,S436.412
  18. 乌鲁木齐地区马铃薯病毒和类病毒的分子鉴定及检测技术研究,S435.32
  19. 环介导等温核酸扩增技术（LAMP）在霍乱弧菌快速检测中的应用与研究,R440
  20. A、B亚群禽白血病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用,S852.65
  21. OSP-1启动子及与CMV结合的双启动子真核表达载体在奶山羊卵巢壁颗粒细胞中的表达与鉴定,Q782

中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 柑桔类病虫害
© 2012 www.xueweilunwen.com