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多种重要致病病毒核酸检测基因芯片的研制

作　者: 张锦伟
导　师: 姜华；王升启
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 微生物
关键词: 强致病性病毒基因芯片高效液相灵敏度
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 60次
引　用: 1次
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内容摘要

近年来,由病原微生物所引起的传染性疾病给人民的健康、生命以及社会稳定、国家安全带来严重的威胁,且某些强致病性的病原微生物也可能为不法分子或恐怖组织所利用。其中影响范围较大在世界范围内流行的如:Sars冠状病毒、禽流感病毒、猪流感(甲型H1N1病毒),以及季节性爆发的手足口病(主要由EV71、科萨奇A16引起)等,都是由属于微生物领域内无细胞结构的病毒所引起。世界上很多国家将其定为重点防治的重要致病病毒,并且投入了大量的人力、物力进行预防、控制和诊断。我国卫生部已将其列为重点监测对象。此类重要致病病毒主要分为肠道病毒、呼吸道病毒和神经系统病毒。由于上属致病病毒,有较多的传播方式、较快的传播速度,其毒性基因容易被整合,其极可能引起世界范围内大规模的爆发和流行。对以上病毒所引起的疾病实施正确的防治措施、提供科学的指导,以便准确快速地对致病病毒进行诊断是有效控制其传播速度、预防此类病毒大规模爆发和流行的前提和关键。为使人民的生命健康提高保障,我们必须加强针对这些病毒的监控、检测技术的研究。目前我国对这些病毒的检测方法有传统经典的实验室培养、电镜检测、生理生化检测、荧光定量PCR技术以及通过抗原抗体结合进行检测的免疫方法等,以上这些方法甄别周期较长、操作较复杂、且通量很小,检测的特异性和时效性很差。这些方法难以解决具有爆发范围广、无预见性、感染初期临床症状不明显等特点的重要致病病毒的快速甄别问题。随着生物技术的飞速发展,有许多新的技术如:化学分析技术、生物传感器技术、以及一些核酸测序技术、PCR技术不同程度的被应用到了重要致病病毒的检测中。在20世纪后期发展起来的基因芯片技术,以其对DNA、RNA等核酸分子进行准确、快速、高通量检测的特点,满足了同时分析大量序列的要求,成为了很多实验室研究和实际应用选择的主要鉴定手段,也是目前病原微生物分子生物学诊断的主要发展方向。基因芯片能够在短时间内对多个物种或同一物种的多个基因进行准确快速的检测、筛查。更适合于对大量病原微生物进行快速、高通量的筛选、甄别。本研究通过基因芯片技术结合多重PCR技术,建立针对呼吸道病毒:甲型、乙型流感病毒。肠道病毒:EV71、科萨奇A16、脊髓灰质炎病毒1、2、3型及肠道病毒属其他病毒、轮状病毒A组的甄别方法。为了达到对以上病毒准确检测的目的,选取了各个病毒的特异性探针。研制了检测这些病毒的基因芯片技术。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-17
  1.1 基因芯片技术简介  9-12
    1.1.1 基因芯片技术的产生及分类  9-10
    1.1.2 基因芯片技术原理及技术路线  10-12
  1.2 基因芯片技术在微生物检测中的应用  12-15
  1.3 肠道病毒属病毒概述  15-16
    1.3.1 形态结构  15
    1.3.2 基因组  15
    1.3.3 血清型分类  15-16
  1.4 轮状病毒概述  16-17
  1.5 流感病毒概述  17
2 多种重要致病病毒核酸检测基因芯片的研制  17-31
  2.1 实验材料  17-20
  2.2 实验方法  20-31
    2.2.1 靶基因的选择及引物的设计合成、RT-PCR 体系的初步建立  20-21
    2.2.2 引物的合成  21
    2.2.3 病毒核酸的提取  21-22
    2.2.4 RT-PCR 体系的初步建立  22-23
    2.2.5 试剂盒质控参比品的建立  23-26
    2.2.6 寡核苷酸探针的设计合成及筛选  26-28
    2.2.7 基因芯片的制备  28
    2.2.8 探针的筛选  28
    2.2.9 寡核苷酸芯片最终矩阵的确定  28-29
    2.2.10 分管实验  29
    2.2.11 多重RT-PCR 体系的优化与确定  29-30
    2.2.12 杂交体系的优化  30
    2.2.13 洗涤条件的优化  30-31
    2.2.14 芯片性能评价  31
3 结果与分析  31-46
  3.1 引物的设计与筛选  31-33
  3.2 RT-PCR 扩增结果  33-34
  3.3 参考品的制备  34-35
  3.4 最佳探针的筛选  35-36
  3.5 最终确定芯片阵列  36
  3.6 RT-PCR 体系的优化  36-41
  3.7 杂交体系的优化  41-43
  3.8 洗涤体系的优化  43-45
  3.9 特异性评价  45-46
  3.10 灵敏度评价  46
4 讨论  46-47
结论  47-48
参考文献  48-51
附录病毒名称及其部分序列登录号  51-52
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  52-53
致谢  53

多种重要致病病毒核酸检测基因芯片的研制

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