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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒湖南株全长感染性cDNA克隆的构建

作　者: 袁东波
导　师: 汤德元；赵启祖
学　校: 贵州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒湖南株 RNA体外转录全长感染性cDNA克隆构建
分类号: S852.659.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 22次
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种主要以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病,给养猪业带来了巨大的经济损失。本研究以2006年夏季以来我国南方部分地区陆续发生的高致病性PRRS疫情为背景,用流行的PRRSV湖南株为亲本毒株构建全长感染性cDNA克隆,为实现在DNA水平上对PRRSV基因组进行人工操作和研究PRRSV的复制和致病机理、基因功能等提供技术手段,并为构建新型病毒载体和发展安全有效的疫苗搭建平台。根据已发表的高致病性PRRSV毒株全基因组序列及酶切位点分布,将病毒基因组分9段设计特异性引物,预期扩增覆盖全基因组的重叠cDNA片段为173、174、175、176、177、177p、178、179和215,其大小分别为486bp、2437bp、2059bp、2718bp、2406bp、1450bp、3306bp、2249bp和645bp;同时在序列5’端起始位点引入T7 RNA聚合酶启动子序列和3’端引入含30个A的poly(A)尾及单一线性化酶切位点。首先通过优化的RT-PCR反应体系扩增出目的cDNA片段,并将它们分别克隆入pMD18-T载体进行序列测定和比对分析,获取序列完全正确的cDNA克隆;然后将9个cDNA片段按构建策略进行亚克隆,在2个高拷贝质粒载体pMCS1.1和pMCS2.1的基础上构建4个高拷贝重组质粒A、B1N、B2、C,并将A、B1N、B2、C依次亚克隆到低拷贝质粒pAC1.1中,最终获得含全长cDNA克隆的重组质粒pAC-HPPRRS-F。按低拷贝质粒提取方法大量制备含全长cDNA克隆的重组质粒pAC-HPPRRS-F,随机选取病毒基因组中的5组酶切位点,用限制性内切酶进行酶切鉴定。然后将pAC-HPPRRS-F用MluⅠ线性化后作为模板进行RNA体外转录,经脂质体Lipofectin Reagent转染Marc-145细胞以获得体外拯救病毒。转染48h后取细胞上清接种Marc-145细胞进行传代培养,盲传至第3代时产生了明显的细胞病变,经RT-PCR和免疫组织化学染色检测证实获得了PRRSV,结果表明该研究构初步建出了PRRSV湖南株全长感染性cDNA克隆。

全文目录

中文摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
前言  10-11
实验研究  11-45
  1 材料  11-16
    1.1 毒株、质粒载体与细胞  11
    1.2 主要试剂和耗材  11-12
    1.3 主要仪器设备  12-13
    1.4 主要溶液的配制  13-16
  2 方法  16-38
    2.1 目的DNA片段的扩增与克隆  16-21
      2.1.1 病毒RNA的制备  17
      2.1.2 目的DNA片段的RT-PCR扩增  17-19
      2.1.3 PCR产物的电泳与回收纯化  19
      2.1.4 PCR产物末端加A与回收纯化  19-20
      2.1.5 加A产物与质粒载体的连接  20
      2.1.6 连接产物的转化  20
      2.1.7 重组质粒的提取  20-21
      2.1.8 重组质粒DNA的定量  21
      2.1.9 重组质粒的酶切验证与序列测定  21
    2.2 连接载体的构建  21-26
      2.2.1 质粒载体的提取与定量  21-24
      2.2.2 质粒载体的双酶切  24-25
      2.2.3 酶切后质粒的回收纯化  25
      2.2.4 含多克隆位点双链DNA的合成  25
      2.2.5 双链DNA与质粒载体的连接  25
      2.2.6 连接产物的转化  25
      2.2.7 含多克隆位点重组质粒的提取与定量  25
      2.2.8 含多克隆位点重组质粒的单酶切鉴定与序列测定  25-26
    2.3 全长cDNA的连接与克隆  26-35
      2.3.1 双酶切含目的片段的重组质粒与连接载体  32
      2.3.2 酶切后小片段DNA的回收纯化  32
      2.3.3 酶切后大片段DNA的回收纯化  32-33
      2.3.4 目的DNA片段与质粒载体的连接  33
      2.3.5 连接产物的转化  33
      2.3.6 重组质粒的菌液PCR筛选  33-34
      2.3.7 重组质粒的STET法筛选  34
      2.3.8 重组质粒的提取与鉴定  34-35
    2.4 全长cDNA克隆的体外转录  35-36
      2.4.1 含全长cDNA克隆质粒的大量抽提  35
      2.4.2 含全长cDNA克隆质粒的浓缩  35
      2.4.3 重组质粒的酶切线性化与RNAase的去除  35-36
      2.4.4 RNA的体外转录与加帽反应  36
    2.5 病毒的拯救与检测  36-38
      2.5.1 体外转录RNA的脂质体转染  36-37
      2.5.2 盲传拯救的病毒  37
      2.5.3 拯救病毒的检测  37-38
  3 结果与分析  38-42
    3.1 目的DNA片段的克隆与测序  38
    3.2 连接载体的构建  38-42
      3.2.1 pMCS1.1和pMCS2.1的单酶切鉴定  38
      3.2.2 pAC1.1的单酶切鉴定  38-42
    3.3 全长cDNA克隆的酶切鉴定  42
    3.4 全长cDNA克隆的体外转录  42
    3.5 拯救病毒的检测  42
      3.5.1 拯救病毒盲传结果  42
      3.5.2 拯救病毒的RT-PCR检测  42
      3.5.3 拯救病毒的免疫组织化学染色结果  42
  4 讨论  42-45
结论  45-46
文献综述  46-61
  1 PRRS病原学  46-54
    1.1 PRRSV的分类地位  46-47
    1.2 PRRSV的结构与理化特性  47
    1.3 PRRSV的生物学特性  47-49
      1.3.1 PRRSV在细胞中的增殖  47
      1.3.2 PRRSV的抗体依赖性增强作用  47-48
      1.3.3 PRRSV的血凝特性  48
      1.3.4 PRRSV的致病特性  48-49
    1.4 PRRSV的基因组与编码蛋白质  49-54
      1.4.1 PRRSV的基因组结构与功能  49-50
      1.4.2 PRRSV基因组的转录与表达  50-51
      1.4.3 PRRSV编码蛋白质的结构与功能  51-54
  2 PRRS疫苗研究  54-58
    2.1 PRRS传统疫苗  54-56
      2.1.1 PRRS弱毒疫苗  54-55
      2.1.2 PRRS灭活疫苗  55-56
    2.2 PRRS新型疫苗  56-57
      2.2.1 PRRS亚单位疫苗  56
      2.2.2 PRRS核酸疫苗  56
      2.2.3 PRRS活载体疫苗  56-57
    2.3 PRRS疫苗研究中需关注的问题  57-58
  3 反向遗传操作技术在PRRSV研究中的应用  58-60
    3.1 反向遗传操作技术在PRRSV研究中的策略  58
    3.2 PRRSV感染性克隆的构建方法  58-59
    3.3 PRRSV全长cDNA克隆的构建研究进展  59-60
  4 结语  60-61
参考文献  61-69
附录1  69-70
附录2  70-71
致谢  71-72

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒湖南株全长感染性cDNA克隆的构建

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