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柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶的研究

作　者: 李洋
导　师: 黄兵
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 柔嫩艾美耳球虫差异表达基因钙依赖蛋白激酶克隆表达功能分析
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 83次
引　用: 6次
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内容摘要

艾美耳球虫为球虫病的病原体,是家禽养殖中最重要的寄生虫。它能够导致禽类的生长缓慢和饲料转化率降低,严重时能引起较高的死亡率,给全世界的养殖业造成巨大的经济损失。目前控制球虫病的主要方法包括活疫苗免疫和药物防治,这些方法在预防和治疗过程中存在虫种扩散、药物残留、产生抗药虫株等问题,所以急需寻找新的防治手段。鸡球虫生活史复杂包括细胞内和细胞外阶段,不同发育阶段虫体形态特征和生存环境各不相同,其基因表达存在差异,功能也不相同。子孢子是球虫入侵宿主细胞的第一个发育阶段,对球虫在宿主细胞内的生长和发育至关重要。对子孢子阶段差异表达基因的研究,有助于了解鸡球虫的入侵和生长发育机制,可为新疫苗和新药物的研制提供新思路。本文以对家禽致病性最强的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)为研究对象,对在子孢子阶段高表达的2个新基因全长cDNA进行克隆、表达及功能分析。1柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段高表达新基因全长cDNA的克隆及分析本研究是在实验室前期利用抑制性消减杂交技术和cDNA微阵列技术大规模筛选了柔嫩艾美耳球虫子孢子和孢子化卵囊差异表达基因,获得了大量差异表达基因ESTs的基础上,选择了2个在子孢子阶段高表达基因的ESTs(克隆号分别为ZB1-H07、ZB7-C11),经Blast同源性比对分析发现ZB1-H07与恶性疟原虫钙依赖蛋白激酶(CDPK)高度同源；ZB7-C11与约氏疟原虫钙依赖蛋白激酶部分同源。利用RACE技术扩增获得了这2个基因的全长cDNA,其中ZB1-H07基因全长1336 bp,含一个1302 bp的ORF,编码433个氨基酸,预测表达蛋白的分子量为49.3kDa; ZB7-C11基因全长1439 bp,含一个525 bp的ORF,编码174个氨基酸,预测表达蛋白的分子量大小为18.7 kDa。对这两个基因编码蛋白的信号肽、疏水性、跨膜结构、理化性质抗原位点和保守功能域等进行了搜索分析预测。结果表明：ZB1-H07编码的蛋白与刚地弓形虫钙依赖蛋白激酶(CDPK)高度同源,因此推测为柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶,命名为EtCDPK; ZB7-C11编码的蛋白与约氏疟原虫钙依赖蛋白激酶只有少量同源,推测为柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段高表达新基因,暂命名为EtC11。2 EtCDPK和EtC11基因的表达及免疫原性分析将EtCDPK基因连接到原核表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒pET(28a)-EtCDPK,再转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达的融合蛋白以包涵体形式出现。利用镍亲和层析柱纯化重组蛋白His-EtCDPK,经Western-blot分析,表明重组蛋白His-EtCDPK具有良好的免疫原性。为了得到可溶性蛋白,进一步分析其功能,将EtCDPK基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC-9K中,转化GS115酵母感受态细胞后,经甲醇诱导表达,获得了可溶性蛋白,Western-blot分析显示也具有良好的免疫原性。将EtC11基因连接到原核表达载体pGEX-4T-2上,构建重组表达质粒pGEX-4T-EtC11,再转化大肠杆菌BL21 (DE3)进行诱导表达,表达的融合蛋白以可溶性形式出现。利用GST层析柱纯化重组蛋白GST-EtC11,经Western-blot分析,结果表明重组蛋白GST-EtC11具有良好的免疫原性。3 EtCDPK功能初步分析3.1免疫荧光定位为了解EtCDPK在子孢子入侵宿主细胞过程的分布情况,将E. tenella子孢子接入到培养好的鸡成纤维细胞DF-1中,观察子孢子在48 h内的入侵及发育过程。利用免疫荧光技术,以PBS孵育1h的子孢子为研究对象,以前期制备的兔血清为一抗,羊抗兔荧光标记的抗体为二抗,观察到EtCDPK在入侵DF-1后2h主要集中分布在子孢子一端,随着虫体进一步发育,表达量增加,在带虫空泡中大量发现,推测EtCDPK与子孢子的入侵和发育相关。3.2入侵抑制分析为了进一步验证EtCDPK是否与子孢子入侵有关,进行了体外抑制试验。先将提取的子孢子与荧光染料CFSE作用1h,再加入制备的兔抗His-EtCDPK抗血清孵育2h,离心后将子孢子加入到培养好的DF-1细胞中发育20 h后通过流式细胞技术仪计数。结果显示抗EtCDPK多克隆抗体能明显抑制子孢子的入侵,与对照组相比抑制率高达68.8%。结果表明EtCDPK与子孢子的入侵相有,在球虫子孢子入侵细胞时可能发挥了重要作用。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章文献综述  14-19
  1.1 CDPKs的结构特征与功能  14-15
  1.2 疟原虫的CDPKs  15-16
  1.3 弓形虫的CDPKs  16-17
  1.4 艾美耳球虫的CDPKs  17
  1.5 展望  17-19
第二章柔嫩艾美耳球虫ZB1-H07、ZB7-C11基因全长cDNA的克隆与分析  19-45
  2.1 引言  19
  2.2 材料与方法  19-33
    2.2.1 实验动物  19
    2.2.2 实验虫株  19
    2.2.3 实验试剂  19-20
    2.2.4 主要仪器  20
    2.2.5 试剂配制  20-22
    2.2.6 EST来源  22
    2.2.7 RACE引物设计  22
    2.2.8 全长cDNA引物设计  22-23
    2.2.9 柔嫩艾美耳球虫孢子化、未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的制备  23-24
    2.2.10 柔嫩艾美耳球虫子孢子Total RNA的提取  24-25
    2.2.11 ZB1-H07、ZB7-C11基因的3’和5’RACE扩增  25-28
    2.2.12 PCR产物的回收  28
    2.2.13 T-easy载体与回收产物连接转化  28-29
    2.2.14 阳性克隆的鉴定及测序  29
    2.2.15 拼接全长序列  29
    2.2.16 扩增全长cDNA序列  29-30
    2.2.17 全长cDNA的克隆和测序  30
    2.2.18 ZB1-H07、ZB7-C11基因的生物信息学分析  30
    2.2.19 ZB1-H07、ZB7-C11基因不同发育阶段表达差异分析  30-33
  2.3 结果  33-43
    2.3.1 柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的纯化  33
    2.3.2 柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子总RNA提取  33-34
    2.3.3 ZB1-H07、ZB7-C11的全长cDNA克隆  34-35
    2.3.4 ZB1-H07、ZB7-C11全长cDNA序列的生物信息学分析  35-42
    2.3.5 ZB1-H07、ZB7-C11基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的表达差异分析  42-43
  2.4 讨论  43-45
第三章 ETCDPK和ETC11基因的表达及免疫原性分析  45-65
  3.1 引言  45
  3.2 材料与方法  45-57
    3.2.1 材料  45-50
    3.2.2 方法  50-57
  3.3 结果  57-64
    3.3.1 原核表达质粒的构建  57
    3.3.2 EtCDPK和EtC11重组蛋白的表达与纯化  57-61
    3.3.3 EtCDPK蛋白在毕赤酵母中的表达  61-64
  3.4 讨论  64-65
第四章 ETCDPK荧光定位和体外抑制分析  65-75
  4.1 引言  65
  4.2 材料与方法  65-68
    4.2.1 材料  65-67
    4.2.2 方法  67-68
  4.3 结果  68-73
    4.3.1 免疫荧光检测EtCDPK在子孢子入侵宿主过程细胞中的分布  68
    4.3.2 体外抑制试验分析EtCDPK是否与子孢子入侵宿主细胞有关  68-73
  4.4 讨论  73-75
第五章全文结论  75-76
参考文献  76-82
致谢  82-83
作者简历  83

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶的研究

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