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荧光假单胞菌7-14鞭毛蛋白合成基因flhA的克隆及功能分析

作　者: 丁运昭
导　师: 胡白石
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业推广
关键词: 荧光假单胞 鞭毛 flhA 突变 功能分析
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


荧光假单胞菌是一类重要的根围促生细菌,能产生抗生素、嗜铁素、蛋白酶HCN等生防物质,能有效防止植物病害。菌株Pf7-14分离于水稻纹枯病病斑,是一株对水稻纹枯病、稻瘟病和恶苗病有拮抗作用的细菌菌株。本研究通过生物信息学和分子生物学的方法从Pf7-14中克隆了鞭毛蛋白合成基因,并对其功能进行了系统阐述。以铜绿假单胞菌UCBPP-PA14（NC008463.1）的鞭毛蛋白FlhA为诱饵,在荧光假单胞菌Pf-5（NC004129）和PfC-1（NC004792）的全基因组中进行BLASTX比对分析,结果在Pf-5和Pf0-1的全基因组比对搜索到FlhA的同系物,分别命名为FlhAPf-5 （YP258790）和FlhAPf0-1 （YP347292）。根据FlhAPf-5和FlhAPf-5的核酸序列,设计兼并引物flhA-F/flhA-R。以荧光假单胞菌pf7-14的DNA为模板,利用引物flhA-F/flhA-R进行PCR扩增,结果扩增得到一段2130-bp的PCR片段,对该片段进行测序后,利用软件CLUSTALW和MEGA3软件进行序列分析,结果表明,FlhAPf7-14在氨基酸水平上同FlhAPf-5和FlhAPf0-1的同源性最高,分别达到93%和94%。有趣的是,FlhApf7-14同水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）中的三型泌出通道（typeⅢsecretion system）中的保守蛋白HrcV具有很高的同源性。Southern杂交证明flhA在Pf7-14基因组中为单一拷贝。在Southern杂交确认flhA在Pf7-14全基因组中单拷贝后,利用同源重组的方式构建了flhA插入失活突变株。在此基础上,利用已克隆的vfr基因的启动子对flhA突变株进行了有效的互补。在游动性试验中,flhA突变株丧失了游动性,而flhA互补菌株则恢复了野生型菌株的游动能力。在电镜观察中,flhA突变株缺失了鞭毛,而flhA互补菌株和野生型菌株则具有多个鞭毛。flhA的突变不影响Pf7-14生物膜合成、嗜铁素、蛋白酶的产生,也不改变Pf7-14对水稻纹枯病菌和油菜菌核病菌的平板拮抗能力。定殖试验表明,flhA突变株在水稻叶片上的定殖能力较野生型显著降低,其定殖时间缩短6天,而flhA互补菌株则部分恢复了野生型的定殖能力。进一步对水稻纹枯病的温室生防试验表明,flhA突变株显著降低了对水稻纹枯病的防效（防效为20.2%）,而flhA互补菌株和野生型对水稻纹枯病的防效分别为52.4%和47.8%

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10上篇 文献综述  10-33  第一章 植物病害生物防治研究进展  11-19    1. 生防制剂  11-16      1.1 微生物杀菌剂  11-13      1.2 农用抗生素  13      1.3 植物源杀菌剂  13-14      1.4 遗传工程菌  14-15      1.5 转基因植物  15      1.6 其它  15-16    2. 生防机制  16-19      2.1 直接作用  16-18      2.2 诱导系统抗性(SAR)  18-19  第二章 荧光假单胞菌与生物防治  19-25    1、荧光假单胞菌的主要种群  19    2、荧光假单胞菌的生防作用  19-20    3、荧光假单胞菌的生防机制  20-25  第三章 细菌鞭毛研究概况及进展  25-31    1、基本特性  25-26      1.1 化学组成  25      1.2 形态结构  25-26    2、染色方法研究  26-27    3、分子生物学研究  27-29      3.1 部分细菌的鞭毛编码基因  27-28      3.2 鞭毛蛋白中央区的可变性  28-29    4、已发现的功能  29-31      4.1 与运动相关  29      4.2 与毒力相关  29      4.3 与抗原性相关  29-31  第四章 假单胞菌鞭毛功能研究进展  31-33下篇 研究内容  33-71  第一章 荧光假单胞pf7-14鞭毛蛋白合成基因flhA的克隆与序列分析  35-55    1 材料与方法  38-46      1.1 试验所涉及的菌株、质粒  38      1.2 培养基及抗生素  38-39        1.2.1 培养基  38        1.2.2 菌株培养条件及保存  38-39      1.3 细菌基因组DNA的提取  39-40      1.4 质粒的提取  40-41      1.5 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算  41      1.6 DNA酶切、连接和PCR扩增产物回收  41-42      1.7 质粒的转化  42      1.8 Southern杂交  42-45      1.9 PCR反应  45-46      1.10 序列分析  46    2 结果与分析  46-54      2.1 荧光假单胞菌pf7-14中flhA基因的克隆、测序  46-48      2.2 荧光假单胞菌pf7-14中flhA_(pf7-14)基因的序列分析  48-53      2.3 flhA_(pf7-14)在基因组中的拷贝数分析  53-54    3、讨论  54-55  第二章 荧光假单胞Pf7-14flhA基因的突变、互补及功能分析  55-71    1 材料与方法  57-61      1.1 试验所涉及的菌株、质粒及培养条件  57      1.2 培养基、抗生素及培养条件  57      1.3 细菌基因组DNA的提取  57      1.4 质粒的提取  57      1.5 DNA酶切、连接、PCR扩增产物回收及质粒转化  57      1.6 Southern杂交  57      1.7 flhA整合突变株的构建  57-59      1.8 flhA互补菌株的构建  59-60      1.9 游动性试验  60      1.10 细胞形态和鞭毛观察  60      1.11 嗜铁素检测  60      1.12 生物膜检测  60-61      1.13 蛋白酶检测  61      1.14 平板拮抗试验  61      1.15 荧光假单胞菌在水稻叶片上的定殖及对水稻纹枯病的防治试验  61    2、结果与分析  61-68      2.1 flhA整合突变株的构建及验证  61-64      2.2 flhA互补菌株的构建及验证  64-65      2.3 flhA突变株缺失了鞭毛装置  65      2.4 flhA丧失了游动能力  65-66      2.5 flhA突变不改变Pf7-14生物膜的形成、嗜铁素和蛋白酶的产生  66-67      2.6 flhA突变不改变Pf7-14对水稻纹枯病菌和油菜菌核病菌的拮抗能力  67      2.7 flhA突变降低了Pf7-14在水稻叶片上定殖时间  67-68      2.8 flhA突变降低了Pf7-14对水稻纹枯病菌的防效  68    3、讨论  68-71参考文献  71-77致谢  77

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治 > 微生物病源的利用
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