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马链球菌兽疫亚种新保护性抗原的鉴定

作　者: 王烨
导　师: 范红结
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 马链球菌兽疫亚种保护性抗原克隆表达动物实验调理吞噬
分类号: S855.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus, SEZ)属于兰氏分群的C群β溶血链球菌,能够感染多种动物及人类。在我国,该菌是猪链球菌病的主要病原,能引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎及突发性死亡,并对相关从业人员的健康构成潜在威胁。尽管目前国内市场上已有多种预防C群链球菌疫苗,但其免疫保护效果往往不能令人满意,因此安全、高效的新型疫苗仍有待研究。本实验室已采用免疫蛋白组学方法筛选马链球菌兽疫亚种ATCC35246株细胞壁相关蛋白,并成功鉴定出10种免疫原性蛋白。多数蛋白在马链球菌兽疫亚种上未曾见报道,其是否为保护性抗原仍需进一步鉴定。本文根据GenBank上已公布的这10种蛋白的基因序列,分析选择免疫原性较好部分的基因序列设计并合成引物。以马链球菌兽疫亚种ATCC35246株基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增出目的基因并定向克隆至表达载体pET-32a(+)、pET-28a(+)中,然后将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)。通过PCR鉴定和重组质粒双酶切鉴定后,挑取阳性克隆菌进行IPTG诱导表达。经SDS-PAGE鉴定,目的蛋白均获得良好的表达,大小与预期值一致。Western-blot显示,融合蛋白均可被猪源ATCC35236株康复血清识别,表明其具有天然蛋白的部分抗原性。重组融合蛋白经亲和层析纯化后,与等量ISA206佐剂进行乳化。通过皮下免疫途径分组免疫ICR小鼠,并以ATCC35246全菌灭活苗和PBS作为对照组。用间接ELISA法检测小鼠血清IgG抗体,并通过体外调理吞噬试验测定抗血清的调理活性。结果表明重组蛋白免疫小鼠后能有效产生免疫应答,血清中抗体水平有明显升高,且有良好的补体依赖的调理吞噬功能。二免后以5LD50 ATCC35246强毒株进行腹腔攻击,结果显示试验组存活率优于PBS对照组,其中免疫EF-G融合蛋白组小鼠的保护率达到50%,免疫TF、TK、GAPDH、PPH融合蛋白组均达到37.5%,表明原核表达产物免疫ICR小鼠,可使其对同源菌株攻击产生一定的保护作用,在亚单位疫苗研制中具有应用价值。

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摘要 8-9ABSTRACT 9-11第一篇文献综述 11-37 第一章马链球菌兽疫亚种与猪链球菌病的研究进展 11-27 1 病原学 12 2 流行病学 12-13 3 临床症状及病理变化 13-14 3.1 临床症状 13 3.2 病理变化 13-14 4 毒力因子与致病机理 14-20 4.1 类M蛋白 14-16 4.2 纤维结合素结合蛋白 16-17 4.3 IgG结合蛋白 17-18 4.4 透明质酸荚膜 18 4.5 链激酶 18-19 4.6 金属结合脂蛋白 19-20 5 猪链球菌病的诊断 20-24 5.1 分离培养及生化鉴定 20-21 5.2 血清学鉴定 21 5.3 分子鉴定 21-24 5.3.1 聚合酶链式反应 21-22 5.3.2 脉冲场凝胶电泳法 22-23 5.3.3 多位点酶电泳法 23 5.3.4 多位点序列分型 23-24 6 猪链球菌病的防治 24-26 6.1 药物治疗 24 6.2 疫苗的研究进展 24-26 6.2.1 弱毒苗 24-25 6.2.2 全菌灭活苗 25 6.2.3 基因工程苗 25-26 7 小结 26-27 参考文献 27-37第二篇研究报告 37-71 第二章马链球菌兽疫亚种新鉴定免疫原性蛋白的原核表达 37-55 1 材料 38-40 1.1 菌株与质粒 38 1.2 主要酶和试剂 38 1.3 主要仪器设备 38 1.4 引物设计及合成 38-40 2 方法 40-47 2.1 模板DNA的提取 40 2.2 PCR扩增 40-41 2.3 PCR扩增产物的回收 41-42 2.4 质粒的提取 42 2.5 重组质粒构建 42-44 2.5.1 PCR扩增产物和质粒的双酶切 42-43 2.5.2 连接 43 2.5.3 感受态细胞的制备 43-44 2.5.4 连接产物的转化 44 2.5.5 重组质粒的鉴定 44 2.6 重组融合蛋白的诱导表达 44 2.7 SDS-PAGE检测重组融合蛋白的表达 44-45 2.7.1 制胶 44-45 2.7.2 上样与电泳 45 2.7.3 染色与脱色 45 2.8 重组融合蛋白的纯化与复性 45-47 2.8.1 重组菌的大量诱导 45-46 2.8.2 包涵体的纯化 46 2.8.3 上清的纯化 46 2.8.4 融合蛋白的复性 46-47 2.9 重组融合蛋白免疫印迹 47 3 结果 47-51 3.1 PCR扩增结果 47-48 3.2 重组菌的PCR鉴定和双酶切鉴定结果 48-49 3.3 重组质粒在BL21中的表达 49-50 3.4 融合蛋白的纯化与鉴定 50-51 4 讨论 51-53 参考文献 53-55 第三章马链球菌兽疫亚种新鉴定免疫原性蛋白对小鼠的免疫效力评价 55-71 1 材料 56 1.1 菌种 56 1.2 主要试剂 56 1.3 主要仪器 56 1.4 试验动物 56 2 方法 56-61 2.1 菌株的复壮 56-57 2.2 ATCC35246株LD_(50)的测定 57-58 2.3 免疫原的制备 58 2.3.1 全菌苗及亚单位疫苗的制备 58 2.3.2 无菌检验与安全检验 58 2.4 小鼠的主动免疫保护性试验 58-59 2.4.1 小鼠的免疫 58 2.4.2 攻毒试验 58-59 2.5 ELISA检测重组融合蛋白抗体效价 59-60 2.5.1 血清样本的采集 59 2.5.2 小鼠抗体动态效价测定 59-60 2.6 调理吞噬试验 60-61 2.6.1 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 60-61 2.6.2 细菌悬液制备 61 2.6.3 调理吞噬 61 2.7 统计学分析 61 3 结果 61-65 3.1 菌株的复壮 61-62 3.2 ATCC35246株对ICR小鼠的LD_(50) 62-63 3.3 安全性检验 63 3.4 重组蛋白对小鼠的免疫保护效力试验 63-64 3.5 ELISA检测重组蛋白抗血清效价 64 3.6 调理吞噬试验 64-65 4 讨论 65-67 参考文献 67-71全文总结 71-73附录 73-77致谢 77

马链球菌兽疫亚种新保护性抗原的鉴定

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