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油菜叶际微生物多样性及其对敌敌畏的降解

作　者: 姜丹
导　师: 王晓辉；白志辉
学　校: 河北科技大学
专　业: 环境工程
关键词: 微生物多样性叶际微生物微生物降解敌敌畏油菜
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 55次
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内容摘要

植物的叶际存在多种类型的微生物,包括不同种类的细菌、丝状真菌、酵母和藻类。这些叶际微生物是植物生态系统中的重要组成部分,发挥着重要的生态功能。伴随着各种农药广泛应用于控制植物的病虫害,其残留问题越来越受到关注,农药残留的生物降解越来越受到重视。关于叶际微生物的多样性及其对农药残留的降解作用鲜见报道。本文采用传统的微生物分离培养方法调查了油菜叶际可培养微生物的多样性,并检测了这些微生物对敌敌畏的降解能力,采用分子生物学方法对细菌进行了初步鉴定和系统发育分析。获得主要结果如下:1)从稀释平板法计数结果表明,油菜的叶际上存在着大量的微生物,牛肉膏蛋白胨培养基上为5.3×105 CFU·g-1鲜叶片、马丁氏培养基上为2.9×103 CFU·g-1鲜叶片,和改良高氏Ⅰ号上的为5.9×104 CFU·g-1鲜叶片。在三种培养基上细菌总数分别为5.2×105 CFU·g-1鲜叶片和8.7×102 CFU·g-1鲜叶片和3.8×104 CFU·g-1鲜叶片,占微生物总量的94%。2)从三种培养基上分离出细菌60株,真菌54株,并对细菌16S rDNA序列进行了分析。16S rDNA序列分析表明,油菜叶际具有较为丰富的可培养细菌种群,最终分离获得36株菌落形态各异的细菌。主要包括厚壁菌门(Firmicutes,16株)、变形菌门(Proteobacteria,14株)、放线菌门(Actinobacteria,4株)和拟杆菌门/绿菌门(Bacteroidetes/Chlorobi group,2株);其中,芽孢杆菌属(Bacillus)为优势菌属,占菌株总数的35%。3)从油菜叶面上筛选得到2株能够高效降解敌敌畏的细菌,命名为N20和N2。这些菌经16S rDNA序列分析和系统发育分析,鉴定为Bacillus cereus和Janibacter sp.,在牛肉膏蛋白胨培养基中,对敌敌畏的降解率24 h内可达80%以上。4)研究了一株从土壤中分离、筛选的类球红细菌(编号为EBL0706)在水溶液中降解敌敌畏的特性,在pH 6.9~7.5、温度20~50℃条件下,在5×108 CFU·mL-1的类球红细菌稀释液中,400 mg·L-1的敌敌畏在12 h内降解率达到98%以上,其降解敌敌畏的机理主要是矿化作用。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-10
第1章绪论  10-17
  1.1 叶际微生物的生存环境  10-11
    1.1.1 湿度  10
    1.1.2 紫外线  10-11
    1.1.3 叶面营养条件  11
    1.1.4 叶面地势  11
  1.2 叶际微生物群落组成  11-12
  1.3 叶际微生物的生态功能  12-14
    1.3.1 改变宿主微环境  12-13
    1.3.2 防御病害  13
    1.3.3 生物固氮  13-14
    1.3.4 促生作用  14
    1.3.5 作为外源基因载体  14
  1.4 叶际微生物群落多样研究进展  14-15
  1.5 本项目的立题背景和研究意义  15-17
第2章油菜叶际可培养微生物的多样性  17-42
  2.1 仪器与试剂  17-21
    2.1.1 实验仪器  17-18
    2.1.2 主要试剂  18-20
    2.1.3 主要溶液的配制  20
    2.1.4 培养基  20-21
  2.2 实验方法  21-26
    2.2.1 植物样品  21
    2.2.2 从植物叶面提取微生物  21
    2.2.3 油菜叶际微生物数量的测定  21-22
    2.2.4 菌株的保藏与活化  22
    2.2.5 油菜叶际细菌的DNA 提取  22-23
    2.2.6 16S rDNA 扩增  23
    2.2.7 酶切反应  23-24
    2.2.8 PCR 产物的切胶回收  24
    2.2.9 T-载体连接  24
    2.2.10 转化大肠肝菌DH5α感受态细胞  24-25
    2.2.11 克隆子的筛选与验证  25
    2.2.12 克隆子的液体培养与测序  25
    2.2.13 细菌种群多样性分析  25-26
  2.3 实验结果  26-39
    2.3.1 油菜叶际微生物的多样性  26
    2.3.2 菌种的分离、纯化  26-30
    2.3.3 细菌菌种的初步筛选  30-32
    2.3.4 油菜叶际细菌的分离和计数  32
    2.3.5 牛肉膏蛋白胨培养基上油菜叶际细菌的系统发育学分析  32-35
    2.3.6 马丁氏培养基上油菜叶际细菌的系统发育学分析  35-38
    2.3.7 改良高氏Ⅰ号培养基上油菜叶际细菌的系统发育学分析  38-39
  2.4 试验讨论  39-40
    2.4.1 油菜叶际微生物的数量  39-40
    2.4.2 油菜叶际细菌的多样性  40
  2.5 小结  40-42
第3章油菜叶际微生物对敌敌畏的降解作用分析  42-49
  3.1 仪器与试剂  42-44
    3.1.1 实验仪器  42-43
    3.1.2 主要试剂  43-44
    3.1.3 培养基  44
  3.2 实验方法  44-45
    3.2.1 菌株的活化  44
    3.2.2 敌敌畏降解试验  44
    3.2.3 敌敌畏残留的测定  44-45
  3.3 实验结果  45-47
    3.3.1 牛肉膏蛋白胨培养基上分离菌体对敌敌畏降解  45
    3.3.2 高氏Ⅰ号培养基上分离菌体对敌敌畏降解  45-46
    3.3.3 马丁氏培养基上分离菌体对敌敌畏降解  46-47
  3.4 讨论与小结  47-49
第4章一株类球红细菌及其降解敌敌畏的特性  49-60
  4.1 仪器与试剂  49-51
    4.1.1 实验仪器  49-50
    4.1.2 主要试剂  50-51
    4.1.3 培养基  51
  4.2 材料与方法  51-53
    4.2.1 类球红细菌的活化  51
    4.2.2 类球红细菌的16S rDNA 扩增  51-52
    4.2.3 类球红细菌16S rDNA 序列测定和系统发育分析  52
    4.2.4 类球红细菌在水溶液中降解敌敌畏农药  52-53
    4.2.5 类球红细菌降解白菜叶面上残留的敌敌畏农药  53
    4.2.6 农药残留分析  53
  4.3 结果和讨论  53-59
    4.3.1 类球红细菌的生长特性  53-54
    4.3.2 类球红细菌的常规检测鉴定  54
    4.3.3 类球红细菌的16S rDNA 序列分析  54-55
    4.3.4 水溶液的pH 对类球红细菌降解敌敌畏效率的影响  55-56
    4.3.5 水溶液中敌敌畏的浓度对类球红细菌降解效率的影响  56-57
    4.3.6 水溶液中类球红细菌培养液的浓度对其降解敌敌畏效率的影响  57
    4.3.7 水溶液的温度对类球红细菌降解敌敌畏效率的影响  57-58
    4.3.8 类球红细菌降解白菜叶面上残留敌敌畏的特性  58-59
    4.3.9 类球红细菌对其他农药的降解特性初试  59
  4.4 结论  59-60
结论  60-61
参考文献  61-66
攻读硕士学位期间所发表的论文和申请的专利  66-67
致谢  67

油菜叶际微生物多样性及其对敌敌畏的降解

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