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有机磷农药降解菌的分离鉴定及其产酶特性研究

作　者: 解顺昌
导　师: 蔡慧农
学　校: 集美大学
专　业: 微生物学
关键词: 有机磷农药微生物降解布朗克假丝酵母米曲霉黄蓝状菌分离鉴定产酶特性
分类号: X172
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

有机磷农药的广泛使用造成了严重的环境问题,并已对人类健康带来潜在危害。有机磷农药残留的去除尤为重要,有机磷农药降解微生物及其产生的降解酶是消除有机磷农药污染的有效、安全的方法,最具应用前景。从有机磷农药污染的土壤中分离得到的三株有机磷农药降解菌:JMUPMD-1,JMUPMD-2,JMUPMD-3,利用形态观察、生理生化实验和rDNA ITS序列分析分别对三株菌进行鉴定。对JMUPMD-3菌株产有机磷农药解酶进行摇瓶培养优化,根据优化结果进行7 L罐发酵,对菌株的发酵动力学进行分析。JMUPMD-1的rDNA ITS序列与布朗克假丝酵母(Candida blankii)的同源性为99%,形态特征和生理生化特性与布朗克假丝酵母相符合,因此鉴定为布朗克假丝酵母。JMUPMD-2 rDNA ITS序列与米曲霉(Aspergillus oryzae)的同源性为99%,菌落形态和显微形态都与米曲霉特征相符,鉴定为米曲霉。JMUPMD-3的rDNA ITS序列与黄蓝状菌(Talaromyces flavus)同源性为99%,形态特征与黄蓝状菌基本符合,鉴定为黄蓝状菌(无性世代为Penicillium vermiculatum Dangeard)。三株菌产生的甲基对硫磷(Parathion-methyl,PM)降解酶均属于胞内酶,其中,T. flavus JMUPMD-3的产酶能力最强。摇瓶优化后的培养基及培养条件为:蔗糖19.0 g/L,酵母膏3.2 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KCl 0.5 g/L,FeSO4·7H2O 0.018 g/L,Triton X-100 2% (v/v),甲基对硫磷乳油0.2% (v/v),发酵液初始pH 8.0,培养温度24℃。用初始培养基在7 L罐中发酵T. flavus JMUPMD-3,PM降解酶活力最高为46.1 U/L,采用优化的培养基和培养条件发酵,PM降解酶活力最高为127.1 U/L,比第一批提高了183%。在第二批7 L罐发酵基础上,取消Triton X-100添加,并维持发酵过程培养基的pH为6.0,生物量提高3.2 g/L,最高酶活力水平持平,但稳定期延迟。动力学分析表明,菌株对数生长期的24 h?56 h,PM降解酶的合成与菌体的生长相偶联,PM降解酶的合成与PM的消耗有关,而PM的消耗不受酶产生的影响。PM降解酶对敌敌畏也有良好降解作用,可能属于广谱性有机磷农药降解酶。分离到三株有机磷农药降解真菌:Candida blankii,Aspergillus oryzae,Talaromyces flavus,其中Candida blankii和Talaromyces flavus降解有机磷农药的报道较少,增加了新的有机磷农药降解真菌资源。对T. flavus JMUPMD-3产PM降解酶进行了摇瓶优化和7 L罐发酵初试,为进一步提高菌株产PM降解酶活力奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
第1章引言  11-21
  1.1 有机磷农药的结构  11-12
  1.2 有机磷农药生产和使用  12
  1.3 有机磷农药的环境污染现状和危害  12-13
  1.4 有机磷农药残留量主要分析方法  13-14
    1.4.1 薄层色谱法  13
    1.4.2 气相色谱法  13-14
    1.4.3 气相色谱-质谱联用  14
    1.4.4 高效液相色谱法  14
  1.5 有机磷农药降解途径  14-19
    1.5.1 光催化降解  14-15
    1.5.2 氧化降解  15
    1.5.3 微生物降解  15-19
  1.6 本论文研究的目的和意义  19-20
  1.7 本论文研究的主要内容  20-21
    1.7.1 有机磷农药降解菌的分离  20
    1.7.2 有机磷农药降解菌的鉴定  20
    1.7.3 Talaromyces flavus JMUPMD-3 产酶特性  20-21
第2章有机磷农药降解菌的分离  21-29
  2.1 材料  21-22
    2.1.1 主要试剂  21
    2.1.2 培养基  21
    2.1.3 主要溶液及配制  21
    2.1.4 主要实验仪器  21-22
  2.2 方法  22-25
    2.2.1 有机磷农药降解菌的分离  22-23
    2.2.2 有机磷农药的检测  23-24
    2.2.3 菌株甲基对硫磷降解酶液制备及活性测定  24-25
  2.3 结果与分析  25-27
    2.3.1 有机磷农药降解菌的分离  25
    2.3.2 菌株对甲基对硫磷的降解能力  25-26
    2.3.3 菌株提取液降解甲基对硫磷的酶活性  26-27
  2.4 讨论  27-28
  2.5 小结  28-29
第3章有机磷农药降解菌的鉴定  29-45
  3.1 材料  29-31
    3.1.1 菌种  29
    3.1.2 主要试剂  29
    3.1.3 培养基  29-30
    3.1.4 主要溶液及其配制  30
    3.1.5 主要实验仪器  30-31
  3.2 方法  31-34
    3.2.1 有机磷农药降解菌的分子鉴定  31-32
    3.2.2 有机磷农药降解菌的形态特征和生理生化特性  32-34
  3.3 结果与分析  34-43
    3.3.1 JMUPMD-1 菌株的鉴定  34-37
    3.3.2 JMUPMD-2 菌株的鉴定  37-40
    3.3.3 JMUPMD-3 菌株的鉴定  40-43
  3.4 讨论  43-44
  3.5 小结  44-45
第4章 T. flavus JMUPMD-3 产甲基对硫磷降解酶的特性  45-65
  4.1 材料  45-47
    4.1.1 菌种  45
    4.1.2 主要试剂  45
    4.1.3 培养基  45-46
    4.1.4 主要溶液及其配制  46
    4.1.5 主要实验仪器  46-47
  4.2 方法  47-50
    4.2.1 单孢子悬液的制备  47
    4.2.2 生物量的测定  47
    4.2.3 甲基对硫磷的测定  47
    4.2.4 甲基对硫磷降解酶活力测定  47
    4.2.5 蔗糖的测定  47-49
    4.2.6 摇瓶培养优化  49
    4.2.7 7L 罐发酵培养  49-50
    4.2.8 甲基对硫磷降解酶广谱性实验  50
  4.3 结果与分析  50-62
    4.3.1 第一批7 L 罐发酵  50-51
    4.3.2 不同碳源种类对T. flavus JMUPMD-3 发酵的影响  51
    4.3.3 不同氮源种类对T. flavus JMUPMD-3 发酵的影响  51-52
    4.3.4 初始蔗糖浓度对T. flavus JMUPMD-3 发酵的影响  52-53
    4.3.5 初始酵母膏浓度对T. flavus JMUPMD-3 发酵的影响  53-54
    4.3.6 初始PM 浓度对T. flavus JMUPMD-3 发酵的影响  54
    4.3.7 初始pH 对T. flavus JMUPMD-3 发酵的影响  54-55
    4.3.8 不同培养温度对T. flavus JMUPMD-3 发酵的影响  55-56
    4.3.9 第二批7 L 罐发酵  56-57
    4.3.10 第三批7 L 罐发酵  57-62
    4.3.11 有机磷农药降解酶对敌敌畏的降解作用  62
  4.4 讨论  62-64
  4.5 小结  64-65
第5章结论与展望  65-66
  5.1 有机磷农药降解菌的分离与鉴定  65
  5.2 T. flavus JMUPMD-3 的产酶特性  65
  5.3 展望  65-66
致谢  66-67
参考文献  67-71
在学期间发表的学术论文  71

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