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若干抗病毒活性化合物的成药性研究

作　者: 高琳雁
导　师: 李卓荣
学　校: 北京协和医学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 格尔德霉素衍生物非环核苷衍生物抗病毒成药性
分类号: R914
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

病毒性疾病对人类健康和生命造成了莫大威胁,新型抗病毒感染药物的研究一直是热点领域之一。本研究组在以Hsp90为靶点的抗病毒药物研究中,筛选得到了若干抗病毒活性强和抗病毒谱广的格尔德霉素(GM)衍生物GM-AMPL、LD01、 GM-GP和GM-TC等。另外,在进行新核苷衍生物的合成与筛选研究中,得到的替诺福韦长链烷基单酯衍生物ODE-TFV显示有进一步开发研究价值。在前期工作的基础上,为充分阐述抗病毒活性化合物GM-AMPL、LD01、GM-GP和GM-TC的开发应用前景,本论文对其前期成药性进行了综合评价研究。同时,为配合进一步研发工作的需要,对抗病毒候选药物ODE-TFV的分析检测及质量控制方法进行了研究。第一部分是格尔德霉素衍生物GM-AMPL、LD01、GM-GP和GM-TC的合成及成药性研究。在前期研究的基础上,对上述GM衍生物的合成制备、理化性质与稳定性、体内抗鸭肝炎病毒活性、口服吸收、小鼠急性毒性、对Beagle犬呼吸与心血管系统毒性等进行了前期综合评价研究。理化性质与稳定性：GM-AMPL、LD01、GM-GP和GM-TC在水及正辛醇中的溶解度分别为0.41及0.78、5.41及8.38、3.30及0.0082和2.62及0.22mg/ml,普遍较先导物GM(0.13及0.041mg/m1)明显提高；GM-AMPL的甲醇溶液经4500Lx光照1h降解不到3%,相同条件下,GM降解接近50%。体内抗DHBV效果：采用鸭肝炎模型动物,分别灌胃给予不同剂量(0.05、0.025和0.0125mmo1/kg)的GM-AMPL、LD01、 GM-GP和0.2mmol/kg的对照药拉米夫定(3TC),1天2次,连续10天。分别在给药前(T0)、给药后5天(T5)、给药后10天(T10)和停药后3天(P3),取血分离血清,测定药物对鸭血清乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)的影响。实验结果显示,与病毒对照组相比,不同实验剂量下,GM-AMPL、LDO1及GM-GP均显示显著的抑制鸭血清DHBV DNA的作用,在0.05mmol/kg剂量下的DHBV抑制活性强于/相当于对照药3TC,停药后3天鸭血清DHBV水平无反跳。测试的GM化合物中,GM-AMPL的体内抑制鸭血清DHBVDNA的效果最强。口服生物利用度：SD大鼠单次灌胃给药GM-AMPL(25mg/kg)、LD01(25mg/kg)和GM-GP(7.5mg/kg)的生物利用度分别为26.36%、1.72%和8.89%。小鼠单次给药的急性毒性：对比研究了小鼠静脉和腹腔注射给药GM-AMPL、LD01、GM-GP的急性毒性。GM-AMPL、LD01、GM-GP单次静脉注射给予小鼠的LDso分别为152.6、82.01和19.2mg/kg,单次腹腔注射的LDso分别为295.4、203.8和35.5mg/kg。对Beagle犬呼吸和心血管系统的毒性：用累计给药方法进行不同剂量试验,给药后5-180min期间连续采集Beagle犬血压、心电、呼吸等各项指标的数据,在药后不同时间点对动物血压、心电、呼吸指标进行了测量、分析和评估。结果显示,GM-AMPL:单次静脉注射剂量分别为5、10、15、20μg/kg和10mg/kg。注射15μg/kg在给药后2min内可引起Beagle犬血压明显下降,呼吸频率加快；注射20μg/kg后,可引起心率减慢,血压明显下降,呼吸频率加快；注射10mg/kg后可引起动物死亡。对Beagle犬呼吸和心血管系统无明显影响的安全剂量小于15.0μg/kg；LD01：单次静脉注射药1.0μg/kg和0.5、2.0、8.0mg/kg,在给药后均可引起Beagle犬心率减慢,血压明显下降,呼吸频率加快；对Beagle犬呼吸和心血管系统无明显影响的安全剂量小于1.0μg/kg；GM-GP:单次静脉注射给予Beagle犬10、11、16、21和25μg/kg,在给药后2min内即可引起心率减慢,血压明显下降,呼吸频率加快；单次静脉注射对Beagle犬呼吸和心血管系统无明显影响的安全剂量小于10μg/kg。第二部分是非环核苷衍生物ODE-TFV分析检测方法的摸索。为配合进一步研究开发工作需要,论文对抗病毒侯选药物ODE-TFV的纯度及主要有关杂质分析检测方法进行了探索研究,研究内容主要包括：ODE-TFV的理化性质与稳定性、主要有关物质分离分析与纯度检测方法、光学异构体的拆分等。研究结果显示：ODE-TFV在中性水中难溶,但由于其分子结构中有一游离磷酸羟基呈现较强酸性,因此,其在水中的溶解性与pH有关,随着碱性升高其溶解性增大。ODE-TFV在单一溶剂乙醇或氯仿中加热都可溶解、易溶于乙醇和氯仿(20/80)的混合溶液。ODE-TFV制备过程中涉及到的中间体及可能副产物的理化性质差别很大,而且,产品具有光学活性,因此,目标药物的纯度检测及主要有关杂质分析方法比较复杂。采用HPLC梯度洗脱法,成功实现了对具有紫外吸收的主要有关物质的分离分析检测。确定了关键中间体TFV的光学拆分条件,用于对目标药物光学纯度的暂时控制测定法。考察了ODE-TFV在加速条件下(高温、高湿)的稳定性,以及在强酸、强碱、强氧化剂和光照条件下的降解情况。研究结果显示,ODE-TFV在60℃高温、相对湿度90%及0.1mol稀盐酸、0.1mol稀NaOH条件下比较稳定,在浓盐酸(0.5mol以上)、浓NaOH(0.5mol以上)和氧化剂(H2O2)中有一定降解,降解方式主要为酯基的水解。ODE-TFV对光照不稳定,降解产物有待鉴定。论文两部分研究工作均取得明显进展和结果,格尔德霉素衍生物的综合评价研究结果提示,GM-AMPL、LD01和GM-GP等的抗病毒效果确切,但对Beagle犬的心脏毒性很强,具有较高的毒性风险。ODE-TFV的分析检测方法及质量研究结果,初步阐述了侯选化合物ODE-TFV的性质、对ODE-TFV主要有关物质及纯度检测中的关键技术进行了有益探索,为目标药物的进一步研发奠定良好基础。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-12
第一部分格尔德霉素衍生物的合成及成药性研究  12-38
  一. 研究背景及目的  12-14
  二. GM衍生物研究结果  14-35
    1. GM衍生物的合成  14-15
      1.1 GM-AMPL、LD01和GM-GP的合成  14-15
      1.2 GM-TC的合成  15
    2. GM衍生物的活性和毒性测定  15-22
      2.1 抗病毒活性结果  16-21
      2.2 毒性研究结果  21-22
    3. GM衍生物的理化性质测定  22-28
      3.1 GM及其衍生物在不同溶剂中溶解度及脂水分配系数的测定结果  23-27
      3.2 GM及其衍生物旋光度的测定结果  27-28
    4. GM衍生物的光照稳定性考察  28-32
    5. GM衍生物的药代动力学考察  32-35
  三. 小结与结论  35-38
第二部分非环核苷衍生物ODE-TFV分析检测方法的摸索  38-94
  一. 研究背景及目的  38-41
  二. ODE-TFV样品研究结果  41-93
    1. ODE-TFV理化性质的测定结果  41-47
    2. ODE-TFV纯度控制方法的确定及其与杂质成份的分离与分析  47-72
    3. ODE-TFV的光学异构体拆分  72-78
    4. ODE-TFV稳定性初步考察研究  78-93
  三. 结论  93-94
总结  94-97
实验部分  97-113
  一、GM衍生物成药性的评价  97-109
    1. GM衍生物的合成  97-100
    2. GM衍生物对鸭血清DHBV DNA复制的抑制实验  100
    3. GM衍生物急性毒性研究  100-102
    4. GM衍生物对Beagle犬呼吸和循环系统的影响研究  102-103
    5. GM及其衍生物的理化性质研究  103-104
    6. 光照稳定性  104
    7. 衍生物GM-AMPL、LD01、GM-GP在大鼠体内生物利用度研究  104-107
    8. 衍生物GM-TC药代动力学初步研究  107-109
  二、ODE-TFV的分析检测方法研究  109-113
    1. ODE-TFV理化性质研究  109-111
    2. ODE-TFV及其主要有关物质的分离与分析研究  111
    3. 光学异构体的拆分研究  111-112
    4. ODE-TFV及其钠盐的稳定性的研究  112-113
主要参考文献  113-117
附录部分  117-136
缩略词一览  136-138
综述  138-149
  参考文献  146-149
致谢  149-150
攻读博士期间发表文章  150-151

若干抗病毒活性化合物的成药性研究

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