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MAVS通过VDAC1诱导细胞凋亡的分子机制研究

作　者: 管楷
导　师: 钟辉
学　校: 安徽大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 线粒体抗病毒信号蛋白电压依赖的阴离子通道1 细胞凋亡
分类号: Q255
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

MAVS (mitochondria anti-viral signaling protein)是一种在先天免疫途径中发挥重要作用的蛋白。它定位在线粒体外膜上,由N端的CARD(caspase recruitment domain)-like结构域,中间的脯氨酸富积(proline-rich domain)结构域和C端的跨膜(transmembrane, TM)结构域组成。它接受上游RIG-I的信号,并作为接头蛋白,募集下游的TBK1和IKKs,从而磷酸化转录因子IRF-3和IRF-7。磷酸化的IRF-3和IRF-7同源二聚化后进入细胞核,启动I型干扰素基因的表达。MAVS也能通过激活IKKα/β/γ复合体来活化转录因子NF-κB。活化的NF-κB从细胞质转移到细胞核,启动多种炎症因子前体基因的表达,帮助细胞对抗病毒感染。最新的研究结果显示,MAVS可能参与细胞凋亡信号通路。首先,MAVS在细胞凋亡时发生依赖于蛋白酶体和caspase的切割。其次,MAVS可以通过干扰线粒体膜电势,激活caspase-3、caspase-8和caspase-9,诱导的细胞死亡。再次,仙台病毒SeV感染细胞所造成的凋亡效果会因为MAVS的干扰下调而降低。登革热病毒DEN会通过切割MAVS抑制细胞的凋亡作用。然而,MAVS在凋亡中的具体功能仍然不清楚。与MAVS一样,VDAC (voltage-dependent anion channel)也是定位在线粒体外膜上的蛋白,它是一种电压依赖的阴离子通道。哺乳动物VDAC有三种同工型：VDAC1, VDAC2和VDAC3。因为在多数细胞中VDAC1是丰度最高的同工型,所以它是人们主要的研究对象。已知VDAC1的功能是参与线粒体能量代谢,与ATP/ADP在线粒体与胞质之间的运输有关。同时,VDAC1也能形成孔道,允许线粒体中的细胞色素C通过,进入胞质中,是线粒体凋亡信号通路的关键组分。本研究发现MAVS有可能通过VDAC1参与细胞凋亡信号通路。1. MAVS能够诱导细胞凋亡：首先通过MTT实验和Annexin V-FITC/PI染色的流式细胞术检测证实MAVS具有诱导细胞凋亡的功能,且具有一定的剂量依赖性。通过细胞周期阻滞实验,发现MAVS具有延缓细胞周期进程的功能。2. MAVS通过与VDAC1相互作用诱导细胞凋亡：构建了VDAC1小干扰RNA质粒,并将其转染进入细胞干扰下调细胞内源的VDAC1,发现VDAC1的干扰下调对MAVS诱导的细胞凋亡具有抑制作用；构建了各种标签的VDAC1融合蛋白表达质粒,通过免疫共沉淀的实验,发现MAVS与VDAC1在细胞内可以形成复合物；通过免疫沉淀的实验,发现MAVS与VDAC1具有细胞内源性的生理情况下的相互作用；通过Far Western实验,发现MAVS与VDAC1在体外具有直接的相互作用；MAVS的脯氨酸富积结构域和VDAC1 N端α螺旋结构域是它们相互作用的结构域。3. MAVS通过上调VDAC1的蛋白水平影响其介导的细胞凋亡：通过在细胞中过表达MAVS,发现细胞内源的VDAC1的蛋白水平会因此而上升；在MAVS缺陷的细胞系中,内源的VDAC1蛋白表达水平下降。综上所述,本研究发现MAVS通过与VDAC1直接相互作用,增强VDAC1蛋白的稳定性,上调VDAC1蛋白的表达水平,从而起到诱导细胞凋亡的作用。本研究首次对MAVS诱导细胞凋亡的分子机制进行初步的探讨和研究,将MAVS的功能从先天免疫进一步拓展到细胞凋亡,为深入研究病毒感染后通过抑制细胞凋亡促进自身增殖的分子机理和抗病毒相关药物的研发打下基础。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-7
目录  7-9
缩略词表  9-11
引言  11-21
  第一部分 MAVS与VDAC的研究背景  11-17
    1. MAVS的研究背景  11-14
    2. VDAC的研究背景  14-17
  第二部分细胞凋亡  17-19
  第三部分研究目的、方法和意义  19-21
材料与方法  21-29
  1. 菌株和细胞株  21
  2. 实验材料  21-22
  3. 细胞总RNA的提取及反转录PCR  22-23
  4. 引物合成、载体构建及测序  23-24
  5. 质粒的制备  24
  6. GST融合蛋白的制备  24-25
  7. 细胞培养与转染  25-26
  8. 细胞计数  26
  9. MTT法检测细胞活力  26
  10.细胞周期进程阻滞  26-27
  11. Annexin V-FITC/PI染色  27
  12. 免疫共沉淀与免疫沉淀  27-28
  13. Western印迹  28
  14. Far Western实验  28
  15. 其他  28-29
结果  29-40
  第一部分 MAVS能够诱导细胞凋亡  29-32
    1. MAVS能够诱导细胞死亡  29
    2. MAVS能够延缓细胞周期进程  29-31
    3. MAVS诱导的细胞死亡是细胞凋亡  31-32
  第二部分 MAVS通过与VDAC1相互作用诱导细胞凋亡  32-38
    1. MAVS通过VDAC1诱导细胞凋亡  32-34
    2. MAVS与VDAC1具有直接相互作用  34-37
    3. MAVS通过其脯氨酸富积结构域与VDAC1的N端α螺旋结构域相互作用  37-38
  第三部分 MAVS通过使VDAC1更加稳定影响其介导的细胞凋亡  38-40
讨论  40-43
结论  43-44
参考文献  44-49
致谢  49-51
硕士期间发表的论文(第一署名)  51

MAVS通过VDAC1诱导细胞凋亡的分子机制研究

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