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HCV多表位肽及其与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白的构建以及诱导的免疫应答

作　者: 黄小军
导　师: 徐志凯
学　校: 第四军医大学
专　业: 微生物学
关键词: 丙型肝炎病毒多表位多肽重组蛋白细胞免疫免疫应答
分类号: R512.63
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引发慢性肝病的主要病原体。全球约有3％的人口感染HCV，每年约有35万人死于HCV相关的终末期肝病及其并发症。因此，HCV感染已成为全球瞩目的公共卫生问题。目前聚乙二醇化的α-干扰素联合利巴韦林用药是慢性丙型肝炎的标准治疗方案，然而这种方案不仅费用昂贵，仅有约50%的人有效，而且副作用大，患者常常不能耐受和坚持治疗。因此，急需从多途径探索对HCV感染的预防和治疗方法，其中研发有效疫苗对降低HCV感染及相关肝病的发病率具有重要意义。有效的细胞免疫应答在控制HCV感染中起着十分重要的作用，因此近年来以诱导高水平细胞免疫应答为目的的疫苗设计策略备受重视。HCV T细胞表位主要集中在Core、NS3、NS4B、NS5A和NS5B蛋白上，以此为基础的多表位疫苗是新型HCV疫苗研制的一个重要方向。基于构建安全、覆盖人群更为广泛的预防/治疗性疫苗的理念，本研究选择了位于HCV非结构蛋白NS5A、NS4B保守区域的2个CTL表位和Core蛋白上的一个通用Th表位，设计和合成了不同表位及其顺序组合的8条表位肽，并对其诱导HHD-2小鼠细胞免疫应答的能力进行了比较研究；进而将免疫效果最佳的多表位肽VAL-44基因与HCV的NS3截短体基因以及树突状细胞（DC）活化分子EDA基因融合，获得了纯化的EDA-ΔNS3-VAL-44重组蛋白，并研究了其诱导HHD-2小鼠特异性免疫应答的效果。【主要实验方法和研究结果】1. HCV多表位肽的设计合成及其诱导HHD-2小鼠的免疫应答根据细胞毒性T淋巴细胞表位与HLA结合能力（我国人口中约50%为HLA-A2亚型）、与小鼠H2结合能力、所覆盖的病毒基因型等综合因素，借助生物信息学分析，选取了2个评分最高的HCV CTL表位，即NS5A1991~1999（VLSDFKVWL）以及NS4B1793~1801（SMMAFSAAL），再加入一个Th表位，即Core23~44（KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL），进行了不同的排列组合，并辅以2个赖氨酸（Lysine-lysine，KK）作为间隔序列，通过固相多肽合成仪共合成8条不同组合方式的多肽（详见下列）。质谱测序结果表明，多肽的纯度均在95%以上。VL-44（NS5A1991~1999-KK-NS4B1793~1801-KK-Core23~44）SL-44（NS4B1793~1801-KK-NS5A1991~1999-KK-Core23~44）VAL-44（NS5A1991~1999-KK-Core23~44-KK-NS4B1793~1801）SWL-44（NS4B1793~1801-KK-Core23~44-KK-NS5A1991~1999）KWL-44（Core23~44-KK-NS4B1793~1801-KK-NS5A1991~1999）KAL-44（Core23~44-KK-NS5A1991~1999-KK-NS4B1793~1801）VL-20（NS5A1991~1999-KK-NS4B1793~1801）SL-20（NS4B1793~1801-KK-NS5A1991~1999）取6~8周龄的HHD-2小鼠（该小鼠敲除了β2微球蛋白以及MHC I类分子，转入表达人HLA-A2基因的αl、α2结构域、人β2微球蛋白基因）54只，随机分为9组，分别用上述8个多肽进行免疫，并设PBS为对照组。免疫方案：将上述多肽分别与弗氏佐剂等体积充分混匀乳化后，经皮下注射给小鼠，100μg/200μl/只；间隔2周加强免疫一次，共免疫3次；其中第一次免疫用弗氏完全佐剂，后两次免疫用弗氏不完全佐剂。PBS对照组以上述同样方式免疫3次。采用多种方法对上述各组免疫小鼠细胞免疫应答的情况进行了检测：1）脾细胞增殖实验的结果显示，VAL-44、SWL-44、KWL-44这3个多肽免疫均能够明显刺激小鼠的脾细胞增殖（P＜0.05），其中以VAL-44的促进作用最强；2）流式细胞仪检测的结果显示，VAL-44免疫组小鼠的CD4+T细胞和CD8+T细胞百分比均明显高于PBS对照组（P＜0.05）；3）ELISpot检测的结果显示，VAL-44、KWL-44、SWL-44这3个多肽免疫组小鼠分泌IL-2的脾细胞频数均显著高于PBS对照组（P＜0.05），其中以VAL-44免疫组的数值最高；VAL-44、KWL-44、SWL-44、VL-20这4个多肽免疫组小鼠分泌IFN-γ的脾细胞频数均显著高于PBS对照组（P＜0.05），其中亦以VAL-44免疫组的数值最高；4）CTL杀伤实验结果显示，VAL-44、KWL-44、VL-20、SWL-44这4个多肽诱导的杀伤效应均显著高于PBS对照组（P＜0.05），其中以VAL-44免疫组的杀伤效应最强。对上述VAL-44、SWL-44、KWL-44、VL-20等4种有效表位肽与T2细胞表面的HLA-A*0201分子的相对亲和力及其稳定性进行了测定。结果显示，VAL-44和VL-20与HLA-A2具有较高的亲和力；而且其解离时间（DC50）均大于6h，显示稳定性良好。上述结果表明，在本研究选择HCV2个CTL表位和1个通用Th表位所构建的8个多表位肽中，以VAL-44多肽诱导机体细胞免疫应答的能力最强，免疫效果最好。2. EDA-ΔNS3-VAL-44重组蛋白的制备及其诱导的免疫应答为进一步增强多表位肽VAL-44的免疫原性和诱导免疫应答的效果，我们将DC活化分子EDA以及HCV NS3截短体（ΔNS3）的基因相连接（EDA-ΔNS3基因），并将该基因插入到多表位肽VAL-44基因的上游，构建了pET-32a-EDA-ΔNS3-VAL-44原核表达载体，同时构建了含上述不同基因片段的pET-32a-EDA、pET-32a-EDA-ΔNS3和pET-32a-ΔNS3等原核表达载体，酶切、测序鉴定正确后，分别在E.coli中进行了诱导表达。经SDS-PAGE分析，所表达的各重组蛋白与预期分子量一致，Western-blot进一步证实了表达蛋白的特异性；通过亲和色谱技术在活性条件下分别进行纯化，得到了EDA-ΔNS3-VAL-44、EDA-ΔNS3、ΔNS3、EDA等4种重组蛋白。取6~8周龄HHD-2小鼠36只，随机分为6组，即上述4种重组蛋白分别免疫组、EDA-ΔNS3-VAL-44DNA联合重组蛋白免疫组和PBS对照组。免疫方案：4种纯化的重组蛋白均按100μg/只以及poly(I:C)50μg/只的量分别与弗氏佐剂等体积充分混匀乳化后，经皮下注射给小鼠；间隔2周进行加强免疫，共免疫3次；PBS对照组采用上述同样方式注射PBS3次；EDA-ΔNS3-VAL-44DNA联合重组蛋白组的前两次免疫（间隔2周）采用pIRES2-dsRED-EDA-ΔNS3-VAL-44质粒DNA经肌肉注射给小鼠，75μg/只；间隔2周后再用EDA-ΔNS3-VAL-44重组蛋白免疫一次，方法和剂量同前述各重组蛋白免疫组。初次免疫后第2、4、6周，各组小鼠经尾静脉采血，分离血清，采用ELISA方法分别检测血清中的特异性抗体以及IgG2a/IgG1的比值。结果显示，各重组蛋白免疫小鼠的特异性抗体效价均随着免疫时间及次数的增加而逐渐升高，其中EDA-ΔNS3-VAL-44免疫组抗体效价在各组中最高，首次免疫后第4周即达到1:12800；而且EDA-ΔNS3-VAL-44免疫组小鼠血清中的IgG2a/IgG1比值也是各组中最高的，表明该重组蛋白在整个免疫过程中主要以刺激产生IgG2a为主。末次免疫后2周将各组小鼠处死，无菌取脾脏，制备脾淋巴细胞悬液，并采用不同方法对其细胞免疫应答水平进行检测：1）脾细胞增殖实验的结果显示，EDA-ΔNS3-VAL-44免疫可明显促进淋巴细胞增殖（与PBS组相比P＜0.05）；2）流式细胞仪检测的结果显示，EDA-ΔNS3-VAL-44免疫组小鼠的CD4+T细胞和CD8+T细胞百分比均明显高于其他各免疫组（P＜0.05）；3）ELISpot检测的结果显示，EDA-ΔNS3-VAL-44、EDA-ΔNS3、EDA-ΔNS3-VAL-44DNA联合重组蛋白这3个免疫组小鼠分泌IL-2、IL-4及IFN-γ的脾细胞频数均显著高于PBS对照组（P＜0.05），且均以EDA-ΔNS3-VAL-44免疫组的数值最高。3个免疫组分泌IL-2及IFN-γ的脾细胞频数增加均比分泌IL-4的脾细胞频数增加明显；4）各重组蛋白以及EDA-ΔNS3-VAL-44DNA联合重组蛋白免疫均可诱发小鼠产生T细胞介导的特异性杀伤作用（P＜0.05），其中EDA-ΔNS3-VAL-44免疫诱导的杀伤效应显著高于其他各组（P＜0.05）。为进一步评价各融合蛋白免疫小鼠体内的CTL杀伤效果，借助实时定量PCR检测了经水动力注射pIRES2-dsRED-EDA-ΔNS3-VAL-44质粒后各组免疫小鼠肝脏中的EDA-ΔNS3-VAL-44基因（mRNA）水平，结果显示EDA-ΔNS3-VAL-44基因在EDA-ΔNS3-VAL-44重组蛋白免疫组的表达量显著低于其他各免疫组（P＜0.05），表明该重组蛋白诱导的CTL效应可以显著杀伤靶肝细胞。【结论】在本研究设计合成的8条HCV多表位肽中，以VAL-44（其氨基酸序列为：VLSDFKVWL-KK-KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL-KK-SMMAFSAAL）诱导小鼠细胞免疫应答的能力最强，免疫效果最好。将VAL-44多表位肽基因与HCV的NS3截短体基因以及DC活化分子EDA基因融合并诱导表达，获得的纯化EDA-ΔNS3-VAL-44重组蛋白可诱导HHD-2小鼠产生良好的体液免疫及细胞免疫应答，其免疫效果明显优于各单个蛋白的免疫效果；另外还初步证明了该重组蛋白免疫诱导小鼠产生的CTL可杀伤小鼠体内的靶肝细胞。展示出该多表位重组蛋白具有预防和治疗HCV感染的良好潜质，值得进一步深入研究。

HCV多表位肽及其与截短型NS3、DC活化分子EDA重组蛋白的构建以及诱导的免疫应答

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