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铁载体高产菌的筛选及铁载体的分离纯化

作　者: 门晋名
导　师: 李俊峰
学　校: 青岛科技大学
专　业: 药物化学
关键词: 铁载体 CAS检测海洋细菌异羟肟酸儿茶酚
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

铁是生命有机体的必需元素,在生物的代谢过程中起着重要作用。在微生物的代谢过程中,铁元素是多种酶的辅基或激活剂,如细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、铁氧还蛋白及铁硫蛋白酶等都需要铁作为活性基。生物缺铁时上述代谢过程均会受到显著的影响。铁载体(siderophore)是微生物在低铁应激条件下产生的一种能够高效率结合三价铁离子的低分子量(500-1000Da)有机化合物,其生物合成过程受环境中铁离子浓度的严格控制。本研究采用LB培养基和2216E培养基从青岛近海海鱼的肠道和鱼鳃中共分离纯化出326株细菌。通过CAS固体和液体方法共筛选出52株铁载体高产菌株,铁载体表达量均在50%以上。通过高氯酸铁实验、氯化铁实验、Csaky实验和Arown实验,对所筛选出的52株铁载体高产细菌进行铁载体类型检测,结果显示,能够产生异羟肟酸类铁载体的细菌有30株,能够产生儿茶酚类铁载体的细菌有16株,还有13株菌所产的铁载体类型无法确定,其中有8株菌既能够产生儿茶酚类铁载体又能够产生异羟肟酸类铁载体。其中菌株CB-EH-2为产铁载体的优势菌株,铁载体表达量为83.117%,达到6.299mg/L。利用16S rDNA序列比对,发现菌株CB-EH-2属于Cobetia marina。通过考察2,2’-联吡啶以及铁离子浓度对菌株CB-EH-2生长和产铁载体的影响,结果显示：1)当2,2’-联吡啶的浓度为50μmol/L时,铁载体产量最高；当2,2’-联吡啶的浓度超过200μmol/L时,菌株不生长,说明微量的2,2,-联吡啶能够刺激菌株CB-EH-2产生铁载体；2)当铁离子的浓度超过10μmol/L时,菌株处于富铁的环境,从而抑制了菌株铁载体的合成,而铁离子浓度的增加对菌体产量影响不大。采用大孔吸附树脂XAD-2、葡聚糖凝胶色谱(Sephadex HL-20)等方法对菌株CB-EH-2的发酵上清液中的铁载体进行了初步分离纯化,该部分纯化产物能够抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、灿烂弧菌4501和鳗弧菌VB1的生长,同时利用高效液相色谱及电喷雾电离子质谱联用(LC-MS)对部分纯化产物进行了测定,实验结果显示该产物中包含两种物质,其中一种为铁载体,另一种为脂肽类物质。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-11
绪论  11-29
  1.1 铁载体的概念  11-12
  1.2 铁载体介导的铁吸收  12-17
    1.2.1 微生物中的铁吸收  12
    1.2.2 微生物从铁载体获取铁的机制  12-15
      1.2.2.1 概述  12-13
      1.2.2.2 Fe~(3+)-铁载体受体  13-14
      1.2.2.3 TonB-EabB-ExbD复合体  14
      1.2.2.4 以E.coli为例说明微生物运输铁的一般机制  14-15
    1.2.3 微生物铁载体-铁的跨膜运输可能有三种机制  15-16
    1.2.4 微生物中的其它铁运输系统  16-17
      1.2.4.1 Feo系统  16
      1.2.4.2 ABC(ATP-binding cassette)系统  16-17
  1.3 铁载体的结构  17-19
  1.4 产铁载体微生物  19-20
  1.5 铁载体的检测方法  20-22
    1.5.1 化学方法  20-21
      1.5.1.1 儿茶酚法(Catechols)  20-21
      1.5.1.2 异羟肟酸类(Hydroxamates)  21
      1.5.1.3 常规CAS法  21
    1.5.2 生物方法  21-22
      1.5.2.1 限铁生长  21
      1.5.2.2 交叉培养法  21-22
      1.5.2.3 外膜蛋白  22
  1.6 铁载体生物学功能  22-27
    1.6.1 纸浆的漂白作用  23-24
    1.6.2 石油烃的生物降解  24
    1.6.3 海洋中铁、碳、氮循环中的作用  24
    1.6.4 铁载体的抗癌、抗病毒、抗氧化作用  24-25
    1.6.5 铁代谢疾病的治疗  25-26
    1.6.6 鱼病的控制  26
    1.6.7 环境修复  26-27
    1.6.8 核燃料回收  27
    1.6.9 铁载体的其它用途  27
  1.7 本课题研究意义及计划方案  27-29
    1.7.1 课题研究意义  27-28
    1.7.2 课题研究的计划方案  28-29
第二章铁载体高产海洋细菌的筛选  29-49
  前言  29
  2.1 实验材料  29-30
    2.1.1 实验仪器  29-30
    2.1.2 实验试剂  30
    2.1.3 菌株来源  30
  2.2 实验所需培养基、试剂、缓冲液的配制  30-32
    2.2.1 培养基  30-31
      2.2.1.1 LB培养基  31
      2.2.1.2 2216E培养基  31
    2.2.2 实验所需试剂  31-32
  2.3 样品的制备以及菌株的分离纯化  32-34
    2.3.1 样品的来源  32
    2.3.2 样品的制备  32
      2.3.2.1 海鱼的解剖  32
      2.3.2.2 样品的处理  32
      2.3.2.3 样品的稀释  32
    2.3.3 菌株的分离纯化  32-34
      2.3.3.1 菌株的纯化  32-33
      2.3.3.2 革兰氏染色  33-34
  2.4 铁载体高产海洋菌株的筛选  34-35
    2.4.1 铁载体高产海洋菌株的初筛  34-35
      2.4.1.1 CAS固体平板检测  34
      2.4.1.2 CAS双层平板检测  34-35
    2.4.2 铁载体高产海洋菌株的复筛  35
  2.5 铁载体高产菌株的类型研究  35-37
    2.5.1 高氯酸铁实验  35
    2.5.2 FeCl_3实验  35-36
    2.5.3 Csaky实验  36
    2.5.4 Aronw实验  36-37
  2.6 实验结果与分析  37-48
    2.6.1 菌株的分离纯化  37
    2.6.2 革兰氏染色结果  37-38
    2.6.3 铁载体高产菌株的筛选  38-41
    2.6.4 铁载体的类型检测结果  41-48
      2.6.4.1 高氯酸铁检测结果  41-42
      2.6.4.2 FeCl_3检测  42
      2.6.4.3 Csaky检测  42-45
      2.6.4.4 Aronw检测  45-46
      2.6.4.5 不同检测方法的分析  46-48
  2.7 本章小结  48-49
第三章产铁载体优势菌株CB-EH-2的鉴定及特性研究  49-61
  前言  49
  3.1 实验材料  49-51
    3.1.1 实验仪器  49
    3.1.2 实验试剂  49-50
    3.1.3 菌株来源  50
    3.1.4 培养基  50-51
    3.1.5 实验所需配制的试剂  51
  3.2 菌株CB-EH-2的鉴定  51-53
    3.2.1 菌株CB-EH-2基因组DNA的提取  51-52
    3.2.2 电泳检测提取DNA  52
    3.2.3 配制PCR所需体系  52-53
    3.2.4 PCR扩增  53
    3.2.5 PCR扩增产物电泳检测  53
  3.3 菌株CB-EH-2的特性研究  53-54
    3.3.1 不同培养基对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响  53-54
    3.3.2 2,2’—联吡啶对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响  54
    3.3.3 不同铁离子浓度对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响  54
  3.4 实验结果及讨论  54-60
    3.4.1 CB-EH-2的鉴定  54-55
      3.4.1.1 CB-EH-2的PCR扩增产物电泳图  54
      3.4.1.2 CB-EH-2的系统发育树  54-55
    3.4.2 菌株CB-EH-2的特性研究  55-60
      3.4.2.1 不同培养基对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响  55-56
      3.4.2.2 2,2’—联吡啶对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响  56-58
      3.4.2.3 铁离子浓度对菌株CB-EH-2产铁载体能力的影响  58-60
  3.5 本章小结  60-61
第四章高产铁载体菌株的分离纯化及产物的性质研究  61-71
  前言  61
  4.1 实验材料  61-62
    4.1.1 实验仪器  61-62
    4.1.2 实验试剂  62
    4.1.3 菌株来源  62
    4.1.4 实验所需培养基和所需配制的试剂  62
      4.1.4.1 所需培养基  62
      4.1.4.2 所需配制的试剂  62
  4.2 铁载体的分离纯化  62-65
    4.2.1 产铁载体菌株的发酵  62-63
    4.2.2 发酵上清液的吸附  63
    4.2.3 有机溶剂洗脱、浓缩  63
    4.2.4 浓缩样品的抑菌性研究  63
    4.2.5 Sephadex LH-20进一步洗脱样品  63
    4.2.6 高效液相色谱对产物进行检测  63
    4.2.7 样品Ⅱ的特性研究  63-64
    4.2.8 电喷雾一液/质联用(ESI-LC/MS)对样品进行结构推测  64-65
  4.3 实验结果分析与讨论  65-70
    4.3.1 浓缩液的抑菌活性研究  65-66
    4.3.2 样品Ⅰ、Ⅱ的高效液相检测  66-67
    4.3.3 样品Ⅱ的特性研究  67-68
    4.3.4 电喷雾—液/质联用(ESI-LC/MS)检测结果  68-70
  4.4 本章小结  70-71
结论  71-72
参考文献  72-76
附录  76-78
致谢  78-79
攻读学位期间发表的学术论文及申请专利目录  79-80

铁载体高产菌的筛选及铁载体的分离纯化

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