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铁载体合成蛋白VibB的结构和功能以及VibB、VibD的相互作用分析

作　者: 张从刚
导　师: 谷立川
学　校: 山东大学
专　业: 微生物学
关键词: 铁载体霍乱弧菌弧菌素 VibB VibD 乙烯醚键水解磷酸泛酰巯基乙胺化修饰
分类号: Q93-33
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

为了应对铁缺乏的环境,微生物体进化出了复杂的获取铁离子的机制。通常它们可以通过分泌产生一种叫铁载体(Siderophores)的小分子化合物,而这个过程一般是通过相关调节基因在低铁离子浓度条件下解除铁载体合成基因的阻遏而触发。合成的铁载体被释放到环境中,从而对Fe3+产生极强的螯合作用。这种包含铁离子的复合物通过相关的外膜蛋白识别系统和内膜的透性酶系统被运输至细胞内,然后在体内蛋白的作用下将铁离子释放出来。铁载体的合成往往需要多种蛋白的协同作用。霍乱弧菌的铁载体—弧菌素(Vibriobactin)是一种非核糖体多肽(Nonribosome peptide),它的合成需要VibA, B, C, D, E, F, H等蛋白的共同作用。其中VibB是一种双功能蛋白：一方面它可以作为一种乙烯醚键水解酶(Vinyl-ether hydrolases)催化中间产物异分支酸(Isochorismate)的水解,就目前而言,isochorismatase活性中心的催化过程仍然不清楚；另一方面VibB还可以作为一种载体蛋白(Carrier protein, CP),在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶VibD的激活作用下,转运DHB-,参与弧菌素(Vibriobactin)合成的最后环节。在VibD修饰VibB机理方面,关于活性中心水分子的作用机制以及参与催化的金属离子方面仍然存在着不同的看法,这些问题仍待进一步的实验证明。本文主要工作就是通过获取VibB以及VibB-VibD复合物的晶体结构,来理解VibB的生化功能以及VibD对VibB的修饰机制。尽管并没有获得VibB-VibD复合物的晶体,但VibB的相关三维结构最终获得了解析,这其中包括VibB-ISC结构域以及VibB-ISC结构域与Isochorismate复合物结构的解析。通过VibB-ISC结构域及其底物复合物的三维结构分析,我们对isochorismatase活性中心的催化机制有了更加深入的了解,提出了新的观点,并用相关的实验进行了证实。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-6
Abstract  6-9
第一章 VibB、VibD以及两者的相互作用在霍乱弧菌铁载体合成中发挥作用的研究概述  9-19
  第一节引言  9-10
  第二节铁载体(Siderophores)结构和功能的研究进展  10-12
    一、铁载体(Siderophores)的定义  10
    二、铁载体(Siderophores)的结构和类型  10-11
    三、铁载体(Siderophores)获取铁的途径多样性  11-12
  第三节霍乱弧菌铁载体合成蛋白分子水平的鉴定和表征  12-17
    一、vibB、vibD基因的分离鉴定  12-13
    二、VibB蛋白家族的特征  13-15
    三、VibD编码一个磷酸泛酰巯基转移酶  15
    四、VibD对VibB蛋白的修饰机制  15-17
  第四节霍乱弧菌铁载体的合成机制  17-19
第二章 VibB以及VibB-VibD复合物的表达、纯化和结晶  19-51
  第一节引言  19-20
  第二节 VibB以及VibB-VibD的基因克隆、表达和纯化  20-46
    一、实验材料  20
    二、实验方法  20-24
    三、实验的结果和讨论  24-46
  第三节 VibB以及VibB-VibD复合物的结晶筛选和晶体优化  46-51
    一、结晶筛选和晶体优化的基本原理  46-47
    二、晶体筛选和优化的结果  47-51
第三章 VibB晶体结构的解析  51-64
  第一节衍射数据的收集与处理  51-58
    一、X射线衍射的基本原理  51-53
    二、衍射数据收集  53-54
    二、衍射数据处理的实施过程和结果  54-58
  第二节相角的求解  58-61
    一、相角(phase)问题简介  58
    二、分子置换法的基本原理  58-60
    三、分子置换法的实施过程和结果  60-61
  第三节结构的修正  61-64
    一、结构修正的原理  61-62
    二、结构修正的实施过程和结果  62-64
第四章 VibB活性中心的催化机制以及VibB与VibD的相互作用分析  64-79
  第一节实验的理论技术和方法  64-69
    一、突变体的克隆、纯化和表达  64-65
    二、VibB突变体的酶活测定  65-66
    三、最适pH值曲线的测定  66
    四、基因敲除(Gene knockout)  66-69
  第二节 VibB活性中心的催化机制  69-75
    一、VibB ISC结构域的总体特征  69-70
    二、VibB活性中心的构象  70-72
    三、VibB活性中心的质子传递机制  72-74
    四、针对VibB-ISC进行药物设计的可行性测试  74-75
  第三节 VibD对VibB的磷酸泛酰巯基乙胺化修饰  75-79
参考文献  79-83
学位论文评阅及答辩情况表  83

铁载体合成蛋白VibB的结构和功能以及VibB、VibD的相互作用分析

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