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淋巴细胞来源的儿茶酚胺对T辅助细胞分化的影响

作　者: 刘燕
导　师: 邱一华
学　校: 南通大学
专　业: 生理学
关键词: 酪氨酸羟化酶 儿茶酚胺 miRNA载体 AMAXA核转 RNA干扰 T辅助细胞 白介素-4 干扰素-γ
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：随着神经—内分泌—免疫相互作用研究的不断深入,人们发现大鼠和人的免疫细胞均能表达酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）即儿茶酚胺（catecholamine, CAs）合成的限速酶,随后的研究也证实了淋巴细胞自身能分泌儿茶酚胺,并对淋巴细胞的增殖和凋亡产生影响,并在此基础上初步探讨了其作用机制。T淋巴细胞是高度异质性的群体,CD4+T细胞是T细胞中最多的一类亚群,本课题以CD4+T细胞为研究对象,探讨CD4+T细胞自身分泌的儿茶酚胺对于Th细胞分化的影响,从而为神经—内分泌—免疫调节网络增加新的内容。方法：取小鼠肠系膜淋巴结,常规培养淋巴细胞,用磁珠分选法分离和纯化CD4+T淋巴细胞。用逆转录—聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）法检测CD4+T淋巴细胞TH的表达。用Western blot方法检测CD4+T淋巴细胞TH的表达。构建四个针对TH（NM009377.1）基因的pcDNATM6.2-GW/miRNA干扰质粒,用AMAXA neucleofector技术将干扰质粒转染CD4+T淋巴细胞,应用RNA干扰技术抑制小鼠CD4+T细胞TH的表达,用（?） real-time PCR方法和western-blot方法分别检测TH基因和蛋白水平的沉默效果,高效液相色谱法-电化学检测法检测TH基因沉默后胞内CAs含量变化,用流式细胞术检测TH基因沉默后的CD4+T细胞细胞内IL-4和IFN-y的含量。结果：淋巴细胞经分离和纯化后,CD4+T细胞纯度达到98.2%, RT-PCR方法和Western blot方法证明小鼠CD4+T淋巴细胞表达THmRNA以及TH蛋白。构建的4对针对TH基因miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/miRNA经测序鉴定,证明构建成功。AMAXA neucleofector技术转染pcDNATM6.2-GW/miRNA进入CD4+T淋巴细胞,转染效率达60%。实时荧光定量PCR检测小鼠CD4+T细胞转染干扰质粒后TH的干扰抑制效率,pcDNATM6.2-GW/miRNA3, pcDNATM6.2-GW/miRNA4的干扰作用可达70%左右,其中以miRNA4插入片段的抑制作用最为明显。Western blot方法检测干扰质粒的干扰抑制效果,也达70%左右,与real-time PCR结果相一致,以pcDNATM6.2-GW/miRNA4插入片段抑制作用最为明显。高效液相色谱-电化学检测法检测结果证明TH基因沉默后CD4+T淋巴细胞胞内合成儿茶酚胺含量明显降低,流式细胞术检测细胞内细胞因子结果显示TH基因沉默,导致了CD4+T淋巴细胞胞内IL-4含量的下降,而对胞内IFN-γ的含量无明显影响,Th1/Th2比例上升。结论：小鼠CD4+T细胞能表达TH, TH基因的沉默抑制了淋巴细胞来源的CAs的合成,Th细胞来源的CAs促进Th细胞向着Th2方向分化。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-10
第一章 绪论  10-14
  1.1 课题来源、研究目的和意义  10-11
    1.1.1 课题来源  10
    1.1.2 研究目的  10-11
    1.1.3 研究意义  11
  1.2 国内外研究概况  11-13
    1.2.1 国内研究概况  11-12
    1.2.2 国外研究概况  12-13
  1.3 论文的主要研究方法  13-14
第二章 材料与方法  14-35
  2.1 研究资料与仪器设备  14-21
    2.1.1 实验动物  14
    2.1.2 主要试剂  14-16
    2.1.3 菌株,引物引物及miRNA  16-17
    2.1.4 其他一些普通的试剂  17
    2.1.5 主要溶液的配制  17-20
    2.1.6 主要实验仪器  20-21
  2.2 实验流程与方法  21-35
    2.2.1 细胞培养  21
    2.2.2 磁珠分选CD4~+淋巴细胞  21-22
    2.2.3 RT-PCR方法检测CD4~+淋巴细胞表达TH  22-23
    2.2.4 western blot方法检测CD4+淋巴细胞表达TH  23-25
    2.2.5 PCR产物的克隆,构建质粒标准品  25-28
    2.2.6 pcDNATM6.2-GW/-miRNA干扰质粒的构建  28-30
    2.2.7 CD4+淋巴细胞用AMAXA细胞核转染技术转染干扰质粒  30-31
    2.2.8 real-time PCR方法检测TH mRNA沉默效率  31-32
    2.2.9 western blot方法检测TH目的蛋白的沉默效率  32
    2.2.10 高效液相色谱法检测CD4+T淋巴细胞胞内儿茶酚胺含量  32-33
    2.2.11 流式细胞术检测胞内细胞因子含量  33-34
    2.2.12 统计学处理  34-35
第三章 结果  35-47
  3.1 小鼠CD4~+T淋巴细胞表达酪氨酸羟化酶的证据  35-37
    3.1.1 磁珠分选后检测CD4~+T淋巴细胞纯度  35-36
    3.1.2 CD4~+T淋巴细胞表达TH mRNA的证据  36
    3.1.3 CD4~+T淋巴细胞表达TH蛋白的证据  36-37
  3.2 TH基因片段克隆,制备质粒标准曲线  37-38
    3.2.1 RT-PCR结果  37
    3.2.2 质粒测序鉴定  37-38
    3.2.3 实时定量PCR质粒标准曲线  38
  3.3 TH干扰质粒的构建  38-41
    3.3.1 单链退火生成双链  38-39
    3.3.2 测序鉴定连接产物  39-41
  3.4 TH干扰质粒介导CD4~+T淋巴细胞TH基因沉默  41-45
    3.4.1 AMAXA核转技术转染TH干扰质粒进入CD4~+T淋巴细胞  41-43
    3.4.2 实时定量PCR法检测TH基因沉默效果  43-44
    3.4.3 western blot法检测TH蛋白沉默效果  44-45
  3.5 TH基因沉默后CD4~+T淋巴细胞合成儿茶酚胺含量降低  45-46
  3.6 CD4~+T淋巴细胞合成的儿茶酚胺对Th淋巴细胞功能的影响  46-47
第四章 讨论  47-51
第五章 结论  51-52
参考文献  52-56
英文缩写词表  56-57
综述  57-80
  综述参考文献  72-80
在攻读硕士学位期间公开发表的论文与参加的项目  80-81
致谢  81

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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