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人PDE4B2全长与截短突变体的重组表达及比较

作　者: 刘苗苗
导　师: 廖飞
学　校: 重庆医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 环核苷酸磷酸二酯酶4B2 泛素样小分子修饰蛋白融合重组表达碱性磷酸酶偶联的孔雀绿定磷法酶抑制剂筛选
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

对全长人环核苷酸磷酸二酯酶4B2（hPDE4B2：Genebank accessionno. M97515）保留其催化结构域得到截短突变体（152aa-528aa）；将全长hPDE4B2的编码基因序列和截短突变编码序列分别连到His-SUMO原核融合表达载体pReceiver-B13上，构建两种重组融合表达质粒His-SUMO-PDE4B2并转化到大肠杆菌BL-21（DE3）中。在16℃经过1.0mmol/L和0.2mmol/L的IPTG诱导20h后, hPDE4B2全长和截短突变体分别获得分子量约为77kDa和64kDa的融合蛋白,经琼脂糖Ni-NTA一步亲和层析纯化，得到纯度较高的融合蛋白。用碱性磷酸酶偶联的孔雀绿定磷法测得纯化后全长hPDE4最大比活性为0.056U·mg-1，截短突变体最大比活性为1.0U·mg^-1；hPDE4B2全长的Km为8.5±0.1μM （n=2），截短突变体的Km为54±4μM（n=5）。在cAMP为60.0μM时，抑制剂Rolipram对全长hPDE4的Ki为11nM（n=2）而对截短突变体的Ki为0.33μM （n=3），抑制剂罂粟碱PAP对全长hPDE4的K_i为5.3μM （n=2）而对截短突变体的Ki为3.4μM （n=4）。可见，截短突变体比活性更高，但其对底物及抑制剂的亲和力与全长hPDE4B2不同，不能用于筛选PDE4的选择性抑制剂。孔雀绿定磷法能耐受高浓度的融合全长hPDE4B2纯化蛋白。高达30ug/ml的靶酶在终止反应后即使不除去变性蛋白对测定无机磷基本无干扰。在微孔板中用适量的纯化融合全长hPDE4B2，碱性磷酸酶偶联的孔雀绿定磷法测得全长hPDE4B2的动力学参数与用分光光度计测定所得一致；在cAMP为60.0μM时，抑制剂Rolipram对融合全长hPDE4的抑制常数也与用分光光度计测定所得一致。所以，用His-SUMO原核融合表达的全长hPDE4，可用于微孔板系统基于碱性磷酸酶偶联的孔雀绿定磷法高通量筛选磷酸二酯酶抑制剂。

全文目录

英汉缩略语名词对照  6-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
前言  11-15
第一部分磷酸二酯酶 4B2 的表达与纯化  15-27
  第一节磷酸二酯酶 4B2 的表达  15-23
    1 实验材料  15-19
    2 实验方法  19-22
    3 实验结果  22-23
  第二节磷酸二酯酶 4B2 的纯化  23-26
    1 实验材料  23-24
    2 实验方法  24-25
    3 实验结果  25-26
  本部分小结  26-27
第二部分磷酸二酯酶 4B2 的表征  27-33
  1 实验材料  27-28
  2 孔雀绿一磷钼杂多酸复合物显色实验方法  28-29
  3 实验条件的确定  29-30
  4 hPDE4B2 动力学参数的测定  30-32
  本部分小结  32-33
第三部分全长人磷酸二酯酶 4B2 的生物素修饰  33-38
  1 实验材料  33-35
  2 实验方法和结果  35-37
  3 讨论  37-38
第四部分利用孔雀绿定磷法在微孔板系统筛选磷酸二酯酶抑制剂  38-42
  1 实验材料  38-40
  2 实验方法及可行性分析  40-41
  3 实验结果  41
  4 讨论  41-42
全文总结  42-43
附图  43-52
参考文献  52-58
致谢  58-59
攻读硕士学位期间发表的论文  59-60

人PDE4B2全长与截短突变体的重组表达及比较

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