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基于植物提取物的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶抑制剂的筛选

作　者: 李瑾
导　师: 高文运
学　校: 西北大学
专　业: 中药学
关键词: MEP途径 DXS酶抑制剂筛选植物提取物高效液相色谱法
分类号: R284.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

萜类化合物是一类具有良好生物活性,在自然界中分布广泛、种类繁多的异戊二烯类化合物,其生物合成途径主要有两条：甲羟戊酸(MVA)合成途径和2-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)合成途径。据文献报道,大多数人类致病菌及原虫所需要的萜类物质是依靠MEP途径来合成的,而动物和人类则依靠MVA途径来合成其所需的萜类物质。因此,MEP途径中的酶可以作为抗生素筛选的有效靶标。1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)是萜类化合物MEP合成途径中的第一个酶,也是该途径的第一个调控位点,基于这一点筛选出具有DXS酶抑制活性的化合物,从而研发出抗菌谱广、低毒性的新型抗生素显得尤为重要。研究已证实,很多中草药都具有良好的抗菌消炎以及抗病毒活性,而且细菌不易对中药产生耐药性,所以本课题对一些具有良好抗菌活性的中草药提取物抑制DXS酶的活性进行了初步研究,以期发现DXS酶的抑制剂。首先,本文对二十余种具有良好抗菌活性的药用植物进行提取,所得粗提物及初步分离获得的不同部位被用来检测它们对两种细菌源DXS酶的抑制活性。DXS酶催化的反应为D-甘油醛3-磷酸(D-GAP)和磷酸二羟丙酮(DHAP)之间的异构化过程,采用柱前衍生HPLC来检测底物的消耗量或产物的生成量,依此判断所加植物提取物对于该异构化反应的影响,进而筛选出DXS酶的有效抑制剂。本研究还对检测DXS酶的活性体系进行了优化,筛选出底物的最佳浓度,反应的较适温度以及反应时间等。该方法在DXS酶的抑制剂筛选过程中,不需要大型昂贵的仪器,并且所用的底物不含同位素标记,操作步骤简单、快速、而且灵敏度高。本章对19种植物提取物以及6种植物挥发油进行DXS酶活性抑制筛选实验,结果发现核桃(Juglans regia)青皮石油醚萃取物对DXS酶的抑制活性大于20%,五味子(Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.)正丁醇萃取物,板蓝根(Isatis tinctoria L.)、艾叶(Artemisia argyi Levl. Vant.)乙酸乙酯萃取物,紫荆(Cercis chinensis Bunge)果萃余水相,沙棘(Hippophae rhamnoides Linn)挥发油对DXS酶的抑制活性均大于10%。进一步的深入研究仍在进行中。

全文目录

中文摘要  3-4
Abstract  4-5
目录  5-8
第一章绪论  8-23
  1.1 抗生素的概况  8-10
    1.1.1 抗生素的发现及应用  8
    1.1.2 抗生素的发展现状  8-9
    1.1.3 细菌的耐药性及耐药机制  9-10
    1.1.4 抗生素现今发展思路  10
  1.2 萜类化合物概况  10-17
    1.2.1 萜类化合物的定义及其分类  10-11
    1.2.2 萜类化合物的特点  11-12
    1.2.3 萜类化合物生物活性  12
    1.2.4 萜类化合物的生物合成途径及其相互关系  12-14
    1.2.5 DXS酶  14-17
    1.2.6 DXS酶抑制剂  17
  1.3 中药及其抗菌作用概况  17-22
    1.3.1 中药植物概述  17-18
    1.3.2 中药抗菌成分研究  18-20
    1.3.3 中药抑菌作用机制的研究  20
    1.3.4 细菌不易对中药产生耐药性  20-21
    1.3.5 中药有效成分的提取、分离  21-22
  1.4 本课题的研究目的与意义  22-23
第二章抑菌植物提取物的提取及初步分离  23-27
  2.1 实验材料及主要仪器  23-24
    2.1.1 实验材料  23-24
    2.1.2 主要试剂  24
    2.1.3 主要实验仪器  24
  2.2 实验方法  24-25
    2.2.1 植物的提取  24-25
  2.3 实验结果  25-26
  2.4 本章小结  26-27
第三章 DXS酶的制备  27-37
  3.1 实验材料与仪器  27-28
    3.1.1 实验菌株  27
    3.1.2 实验试剂  27-28
    3.1.3 实验仪器  28
  3.2 实验方法  28-34
    3.2.1 DXS酶的制备  28-30
    3.2.2 重组蛋白DXS的纯化  30-31
    3.2.3 SDS-PAGE检测DXS酶纯度  31-32
    3.2.4 Bradford法检测DXS酶浓度  32-33
    3.2.5 纸色谱法检测DXS酶功能  33-34
  3.3 实验结果与讨论  34-36
    3.3.1 重组蛋白DXS的诱导表达结果  34
    3.3.2 SDS-PAGE检测DXS酶纯度结果  34
    3.3.3 DXS酶浓度测定结果  34-35
    3.3.4 DXS酶活性测定结果  35-36
  3.4 本章小结  36-37
第四章柱前衍生-HPLC检测DXS酶催化的D-GAP与DHAP相互异构化反应  37-44
  4.1 实验材料与仪器  37-38
    4.1.1 实验材料  37
    4.1.2 主要仪器  37-38
  4.2 实验方法  38-39
    4.2.1 D-GAP的制备  38
    4.2.2 D-GAP的纯化  38-39
  4.3 HPLC方法检测DXS催化D-GAP的异构化  39-40
    4.3.1 试剂的制备  39-40
    4.3.2 具体实验过程  40
  4.4 实验结果与讨论  40-43
  4.5 本章小结  43-44
第五章 DXS酶催化磷酸丙糖异构化反应最佳条件的建立  44-48
  5.1 实验材料与仪器  44
    5.1.1 实验材料  44
    5.1.2 实验仪器  44
  5.2 DXS酶磷酸丙糖异构化活性反应条件的建立  44-46
    5.2.1 各底物浓度的确立  44-46
    5.2.2 体系反应时间及温度的确立  46
  5.3 实验结果与讨论  46-47
    5.3.1 HPLC检测底物D-GAP在不同浓度下的峰面积值结果  46-47
    5.3.2 DXS酶终浓度的确立  47
    5.3.3 反应时间的确立  47
  5.4 本章小结  47-48
第六章植物提取物对DXS酶抑制活性的筛选  48-57
  6.1 实验材料与仪器  48
    6.1.1 实验材料  48
    6.1.2 实验仪器  48
  6.2 实验内容  48-49
  6.3 实验结果与讨论  49-56
  6.4 本章小结  56-57
结论  57-58
参考文献  58-65
致谢  65

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