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（一）以苯丙氨酰-tRNA合成酶为靶点的新型抗结核药物高通量筛选模型的建立和应用（二）可可西里碱性土壤样品细菌的分离和嗜碱菌株的多相分类研究

作　者: 孙莹
导　师: 余利岩
学　校: 北京协和医学院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 结核分枝杆菌苯丙酰氨tRNA合成酶抑制剂筛选酶活细菌生物学特性 16S rRNA 可可西里
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB1引起的一种严重危害人类健康的传染性疾病。近年来,曾被有效控制的结核病大有卷土重来之势,其重要原因就是对于传统一线抗结核药物的多重耐药菌的急剧出现。因此,迫切需要发现新型低毒、高效抗结核分枝杆菌药物。氨酰-tRNA合成酶在蛋白质的生物合成过程中起了至关重要的作用,它催化氨基酸与相应的tRNA合成氨酰-tRNA。对于病原菌而言,一旦它的某种氨酰-tRNA合成酶受到抑制失去功能,就会导致其蛋白质的生物合成中断以及许多重要的生理过程受影响,那么病原菌在体外或是在宿主体内的生长繁殖也就随之终止。目前,氨酰-tRNA合成酶已成为开发抗结核药物的理想靶点之一。本研究以结核分枝杆菌生长所必须的且与其宿主中相关酶有着较大差异的苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)作为新型抗结核药物的筛选靶点。在本实验中,我们首先从结核分枝杆菌基因组中扩增出pheRS基因(包括pheS和pheT基因),利用构建的原核表达系统pET30a-pheST在大肠杆菌中成功表达了PheRS蛋白,采用NADH比色法检测酶活性的方法建立了酶水平的PheRS抑制剂高通量初筛模型。并以此模型筛选了化合物样品11600个,发酵液样品5200个,筛选得到阳性化合物9个,阳性发酵液37个随后,通过耻垢分枝杆菌作为检定菌的抗菌活性测定及细胞毒性评价后,得到了6个在酶水平和抗分枝杆菌方面均具有良好活性且毒性较低的发酵液阳性样品。同时,初步结果还表明I09FA-00484和I09FA-00494对结核分枝杆菌的PheRS抑制活性呈现出一定的量效关系,且对人的重组PheR抑制作用较弱,呈现出良好的选择性毒性。由于该酶在细菌中是普遍存在的,而且其序列相对比较保守,本研究还检测了阳性发酵液样品对其它革兰氏阳性和阴性病原菌的抗菌活性,结果表明阳性发酵液样品I09FA-00484和I09FA-00494对多种耐药G+细菌如MRSA、MRSE等具有较好的抗菌活性,其中I09FA-00484样品还VRE、对产超广谱β-内酰胺(ESBLs)酶的肺炎克雷伯氏菌和绿脓杆菌表现出一定抑制作用。阳性发酵液样品110AB-00631对所测所有的G+病原菌敏感菌株及其耐药株均有一定抑制作用,110AA-00733对所测15株病原菌均没有体现抗菌活性,但是对分枝杆菌具有较好的选择性抗菌活性。综上所述,通过酶水平筛选、抗菌活性及毒性评价后,本研究得到了4株候选菌株I09FA-00484、I09FA-00494、I10AB-00631和110AA-00733,为发现以PheRS为靶点的新型抗菌药物或先导化合物奠定了基础。可可西里是位于青海玉树藏族自治州的自然环境保护区,由于当地的恶劣气候特点,其土壤微生物多样性很少得到研究。本实验采用5种分离培养基对来源于可可西里的12个盐碱土壤样品进行了选择性分离,共分离得到了5株细菌,其中4株菌分别属于游动微菌属(Planomicrobium)、库克菌属(Kocuria)、气球菌属(Aerococcus)和芽孢杆菌属(Bacillus)等4个属。另有一株乳黄色的嗜碱耐盐细菌CPCC100153,由于其16S rRNA基因序列比对结果显示与最相近的地杆菌属(Geomicrobium)相似性仅为93.5%,因此对菌株CPCC100153开展了生物学特性的研究。该菌革兰氏染色呈阳性、细胞为短杆状、多以2-5个细胞呈簇排列；有运动性,周生多根鞭毛,在细胞近中央处可见椭圆形芽胞。菌株生长温度范围为25-37℃(最适生长温度为28℃),生长pH范围为7.5-10.0(最适生长pH为8.0-9.5)；NaCl耐受范围为0-20%(最适生长NaCl浓度为10%1。该菌酶学特性结果为：明胶液化阳性,脲酶、氧化酶、接触酶反应阳性,以及碱磷酶、酯酶、类脂酯酶、白氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-磷酸水解酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶和N-乙酰-葡萄糖胺酶阳性。可利用D-果糖和七叶灵发酵产酸,利用蔗糖、N-乙酰-氨基半乳糖、乳酸钠、甘油、α-酮戊二酸、萘啶酸、吐温40、α-羧基-丁酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸、氨曲南、丁酸钠、溴酸钠作为唯一碳源。利用甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、KNO3、L-天冬酰胺作为唯一氮源。

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